7.4. Відбір та підготовка проби рослинного матеріалу

Рослини є частиною живих речовин на Землі. На рослинність суші припадає 97% біомаси, а лише решта на тваринний світ та мікроорганізми. Живі організми заселяють гідросферу до найбільших глибин, тропосферу та верхні шари літосфери. Особливістю процесів у живих організмів є їхня висока швидкість, обумовлена участю специфічних каталізаторів – ферментів. Саме у склад ферментів входить більшість біогенних важких металів.

Рослини містять цілу низку органічних та неорганічних, а також органо-мінеральних речовин. Для прикладу вміст речовин у деяких рослинах приведений у табл.7.3.

Таблиця 7.3. Хімічний склад окремих видів рослин (%)

Рослина	Вода	Суха речовина	Сахароза і крохмаль	Пектини	Карбонові кислоти	Клітковина	Геміцелюлоза	Білки	Небілкові нітро-геновмісні сполуки	Жириі смоли	Алкалоїди	Зола	K	Na	Ca	Mg	P
Цукровий буряк, корені	75,7	24,3	17,0	2,6	0,45	1,15	1,10	0,625	0,435	0,03	-	0,50	0,25	0,04	0,04	0,04	0,08
Зерно пшениці	13,5	86,5	66,4			3,0		14,0		1,3	-	1,80	0,60	0,06	0,07	0,15	0,85
Сіно суміші трав	7,0	83,0	29,0			27,0		12,0		2,5	-	6,0	2,6	0,08	2,2	0,4	0,8
Сухе листя тютюну	2,0	98,0	14,4		1,5	34,1		17,8		10,5	2,9	18,0	5,0	0,55	6,81	1,26	0,80

Слід зазначити, що вміст речовин у рослині залежить від частини рослини, від виду рослини, від місця, на якому її вирощують, від стадії вегетації. В агрохімічних дослідженнях, коли визначають якість рослини та її стан, аналізують вміст органічних речовин – білків, вуглеводів, жирів, ефірних масел, вітамінів.

Якщо аналіз проводять в екологічних лабораторіях, то більшу увагу приділяють вмісту речовин, які можуть забруднювати рослину – нітратів та нітритів, важких металів, пестицидів.

Встановлено, що у вегетативних частинах рослини нітрату на 60-80% менше, ніж у генеративних. Збільшення його вмісту відбувається в такому порядку: листкова пластина – листковий черешок – стебло. Якщо у корені моркви поверхневий шар містить на 80% менше нітрату, ніж стержневий, то в корені редиски та у плоді огірка поверхневий шар має його на 70% більше, ніж внутрішній. Вміст нітрату завжди більший, якщо в рослині малий вміст та мала активність ферменту нітроредуктази, що сприяє відновленню нітрату та засвоєнню. Така ситуація складається при вегетації рослин в умовах недостатнього освітлення, оскільки світло активує фермент: у теплицях в зимовий період, у затіненому місці чи надто загущеному. Активність ферменту різна у різних видів рослин. Так у жовтій квасолі та перці нітратів менше, ніж у зеленій.

Вміст важких металів неоднаковий у плодах різного розміру: у малих буряках, моркві, кабачках більше сполук Pb, проте менше Cu, As, Zn. Відрізняється вміст сполук металів у покривних тканинах та м’якоті. Так у морквяному та кабачковому соку більше сполук Cd, зате у соку яблук, гарбузів, буряків менше, а більше у вичавках. У шкірці та насінні гарбузів значно більше Cr, Ni, натомість у соку більше Cu.

Пестициди теж мають різну локалізацію у рослині. Найбільше їх концентрується у місцях стікання з листків – в основі стебла. В плодах найбільше накопичуються пестициди біля черешка, у шкірці (цитрусові), в зовнішніх листках (капуста).

Найбільший вміст речовин у рослині на початкових стадіях її вегетації, а менший під кінець. Крім того вміст речовин, наприклад важких металів, добрив, пестицидів, корелює із забрудненням ґрунтів.

Відбір проби рослинного матеріалу відбувається за принципом усереднення, наприклад, листя у лісі згрібають з різних точок, для аналізу беруть пробу з різної глибини купи листя.

Відбір у польових умовах вегетуючих рослин слід проводити за сухої погоди і найкраще в першій половині дня і основне – з різних точок території. При цьому ґрунти повинні бути однотипними. Відбирають проби рослин по діагоналі поля. Якщо доступ до середини поля ускладнений, то відбирають з двох суміжних полів.

Величина і кількість проб. Відбір здійснюють по-різному залежно від потреби аналізу.

Якщо рослини густо засаджені і є на початковій стадії вегетації, то відбирають 300 одиниць, у пізнішій стадії – 100 одиниць.

Для просапних рослин, які вирощують на полях, кількість може бути значно меншою – 100-200 на початку вегетації та 20-40 під кінець.

Зелені листові (капуста, салат, шпинат) та зернові рослини відбирають з території 1 га. У випадку високорослих рослин з 50 одиниць відбирають добре розвинені нижні листки, з середньорослих (зернові, горох) з 25-30 рослин. Якщо рослина перебуває на ранній стадії розвитку і має лише 2-3 листочки, то беруть 10 рослин з 1 га.

Велика проба зерна, соломи, сіна складає 50-100 кг, а після декількаразового квартування вона зменшується до 2-4 кг.

Відбір насіннячкових рослин проводять з території площею 2 га, коренеплоди відбирають з територій 3 га, а картоплі – з 10 га.

У випадку культур, які транспортують, відбирають проби з кожної машини, фури. Відібрані рослини, наприклад коренеплоди (30-40 штук з кожної партії), розкладають в ряд за величиною і відбирають кожну третю-п’яту.

Часто доводиться аналізувати рослинні продукти у торговельній мережі. Якщо це товар в пучках, ящиках та іншій відкритій тарі, то відбирають декілька штук, але не менше 5 одиниць. Якщо упаковок є 500, то відбирають з них 3%, якщо понад 500 одиниць – 2%.

Проба під час доставки у лабораторію не має змінювати свого стану. Тому зразки відразу зважують, поміщають у скляні банки, поліетиленові мішки або посуд, вказують місце, дату та час забору проби і інформацію про того, хто проводив забір.

Орієнтовна величина проби, яка після усереднення потрапляє у лабораторію, повинна бути у межах: для зернових, овочів та фруктів, ягід 250-500 г; проба кори і коренів має бути не меншою за 600-650 г, а подрібненої кори та коренів – 100 г; цілої рослини трави – 400-600 г; квітів – 300 г; листя і подрібненої трави – 200 г.

Перед початком аналізу оцінюють біологічні характеристики проби: висоту рослин, скільки на рослині пагонів, на якій фазі розвитку перебуває рослина.

Підготовка проби рослинного матеріалу до аналізу

Насамперед одержані в лабораторії проби або доводять до повітряно-сухого стану, або фіксують.

Фіксування проби полягає у її нагріванні протягом короткого часу до температури 80-90С. Інший спосіб – пропарювання гарячою водяною парою протягом 5-15 хв.

Перед доведенням до повітряно-сухого стану спочатку пробу рослини подрібнюють, найкраще перемелюють. Після цього рослинний матеріал, а також зерно, розкладають на поліетиленовій плівці або на кальці чи пергаменті та розрівнюють тонким шаром. Якщо це рослина з товстими стеблами, коренеплоди, то їх розрізають на тонкі шматки і також розкладають та розрівнюють. Пробу висушують тривалий час у добре провітрюваному приміщенні або в сушильній шафі при 30-40С. Можна пробу витримувати у термостаті 30-40 хв при 80-100С, а потім досушувати на повітрі без доступу прямого сонячного випромінювання.

Після висушування пробу подрібнюють ножем, ножицями, на млинку. Слід пам’ятати про можливість потрапляння мікроелементів із застосовуваних інструментів (Fe, Mn, Zn) у пробу. Тому найкращі млинки, які мають корпус з полімерного матеріалу, ножі з нержавіючої сталі. Застосовують і спеціальні подрібнювачі для рослин та коренеплодів. Одержані часточки повинні мати розмір 0,1-5 мм.

Подрібнені зразки зберігають у склянках з притертим корком або в пакетах з поліетилену.

Перед початком аналізу зразок обов’язково перемішують, бо при зберігання частинки залежно від маси перерозподіляються по товщі шару.

Визначення вологості рослинної проби описано в розділі 10.7.

Для визначення вмісту інгредієнтів у пробі в ній або руйнують органічні речовини термічним та хімічним способом, або з проби одержують витяжки (залежно від вимог методики). Процедура підготовки проби подібна на пробопідготовку ґрунтів.

Термічне обзолення проби (сухе обзолення) виконують під час визначення зольності рослини і як етап для визначення загального вмісту мікроелементів.

Рослина на ~95% складається з води та органічних речовин. Переважно завданням аналізу є визначення вмісту інших речовин, зокрема мікроелементів. Для цього у пробі рослини термічно видаляють органічні речовини, після розкладу яких залишаються неорганічні сполуки – зола, яка містить стійкі солі, оксиди, карбонати лужних та лужноземельних металів. У склад золи входять як ті елементі, які містилися в органічних сполуках, так і в неорганічних. Це макроелементи – фосфор, сульфур, нітроген, кальцій, магній, натрій, калій, та мікроелементи – ціла група важких металів, які містяться у ґрунтах та водах. Для визначення зольності рослини абсолютно суху пробу рослини (висушену при 105С) у доведеному до сталої маси тиглі обзолюють у муфельній печі. Спочатку тигель з пробою обзолюють на відкритому полум’ї або дуже повільно в муфельній печі при 200С, поки не перестане виділятися дим. Для кращого обзолення слідкують, щоб часточки рослини лежали у тиглі вільно. Після цього пробу обзолюють при вищій температурі (500-550С) до повного просвітління та до сталої маси. Температуру печі слід підвищувати повільно. Загалом процес обзолення триває до 6 год. Для того, щоб уникнути втрати при прожарюванні, краще температуру не підвищувати понад 500С, при цьому обзолення проводять протягом 5-8 год. Для кращого доступу кисню у процесі обзолення слід піч час від часу відкривати. Після охолодження тигель з золою зважують.

Якщо в золі залишились обвуглені часточки, то додають декілька крапель гарячої води або розведеного розчину Н₂О₂ і знову прожарюють. Можна додати концентровану HNO₃ і підсушити на плитці, а далі продовжити обзолення. За зменшенням маси можна обчислити вміст органічних речовин у пробі рослини, а за масою залишку вміст золи – зольність. Слід зазначити, що неорганічні речовини при цьому утворюють оксиди. Тому таку золу називають „сирою” золою. Якщо попередньо визначена вологість та коефіцієнт вологості проби, то можна обзолювати повітряно-суху пробу.

На хід обзолення впливає природа рослин. Деякі рослини обзолюються швидко. Рослини, які містять більше вологи, піддаються обзоленню повільніше. Цікаво, що ті самі види рослин, але вирощені у південних зонах, піддаються обзоленню швидше, ніж у північних. Це спричинене більшим вмістом силікатів у рослинах, вирощених в холодному і вологішому ґрунті. У золі залишається вільна силікатна кислота, яка може сорбувати мікроелементи. Треба пам’ятати також, що молоді рослини мають більшу зольність, ніж ті самі рослини наприкінці вегетації.

Величина наважки проби залежить від того, що планують визначати – макро- чи мікроелементи та які саме. Орієнтовні величини проби для визначення мікроелементів такі: Zn–0,05-0,2 г; Cu –0,2-0,5 г; B –0,25-1,0 г; Mn–1,0-2,0 г; Mo–1,0-4,0 г; Co–5,0-10,0 г. З величин наважок видно, що більшість мікроелементів можна визначати з одної проби, а лише кобальт з більшої.

Для виконання хімічного аналізу після одержання „сирої” золи її розчиняють у 10% розчині HCl і фільтрують через щільний фільтрувальний папір у мірну колбу на 100,00 мл. Якщо на фільтрі залишається осад можливо H₂SiO₃, то продовжують її руйнування. Для цього по завершенні фільтрування фільтр підсушують і спалюють у тиглі на відкритому полум’ї, а потім у муфельній печі при 450-500С. До сухого залишку додають декілька крапель води, концентрованої H₂SO₄ і HF і поступово нагрівають та випаровують насухо. Процедуру при потребі повторяють. Випаровування припиняють, коли починає виділятися пара SO₂. Так одержують „суху золу”.

Залишок після випаровування розчиняють у 10% HCl і розчин долучають до попереднього фільтрату. Для кращого руйнування органічних речовин золу можна розчиняти у 1-2 мл 30% Н₂О₂.

Іноді застосовують прискорене обзолення термічно та хімічно. Для цього пробу у чашці з термостійкого скла або кварцу нагрівають на пальнику до появи диму, після чого матеріал запалюють і дуже швидко обзолюють при 400С. Чашку з одержаною золою поміщають у пристрій, в якому, подібно як і для ґрунту, парами нітратної кислоти руйнують органічні речовини (див рис. 7.1). Припиняють обзолення, коли проба стає майже білою або червонуватою, якщо в ній багато Fe³⁺, MnO₂. Дальше пробу розчиняють кислотою, як це описано вище.

Хімічне обзолення проби, або мокре, полягає у дії на пробу сильними кислотами-окисниками при нагріванні.

При застосуванні концентрованих H₂SO₄ i HNO₃ 5 г проби поміщають у колбу К’єльдаля, додають по 5 мл кислот з розрахунку на 1 г проби і повільно нагрівають до припинення видалення парів кислот. При потребі додають ще нітратну кислоту, поки не одержать прозорий безбарвний розчин. Замість колби К’єльдаля можна використати термостійку колбу. Після охолодження прозорого розчину його переносять у мірну колбу та доводять дистильованою водою до мітки.

Інша методика обзолення полягає в тому, що спочатку пробу заливають відповідною кількістю концентрованих кислот і витримують без нагрівання приблизно 1 год, або й залишають на ніч, поки рослинна маса не почне обвуглюватися, і лише після цього окиснюють при нагріванні.

Перхлоратна кислота покращує руйнування органічних речовин. Застосовуючи суміш H₂SO₄ i HNO₃ із HClO₄, слідкують, щоб у пробі залишалась H₂SO₄, бо інакше з нітрогеновмісних речовин може утворитись NH₄ClO₄, який є вибухонебезпечний:

8NH₄ClO₄ + 5NH₄HSO₄ 4N₂ + 3HCl + 5H₂SO₄ + 12H₂O.

Спочатку в процесі обзолення виділяється бурий газ NO₂, після чого колбу повільно охолоджують. Потім колбу знову нагрівають до виділення парів SO₂, а тоді ще 5-10 хв і 1-2 хв підвищивши температуру. У випадку залишків золи пробу доокиснюють нітратною кислотою, знову нагріваючи до виділення парів SO₂. Залишок, аналогічно як і в першому випадку, розчиняють розведеною кислотою.

Застосовуючи обзолення концентрованими кислотами, треба слідкувати за тим, щоб проба нагрівалась не надто сильно, бо при цьому швидко розкладається нітратна кислота і випаровується, замість того, щоб окиснювати органічні речовини. Процес окиснення повинен відбуватися без запінювання і кипіння рідини у колбі. Тому протягом всього часу обзолення треба слідкувати за процесом. Перевагою хімічного окиснення органічних речовин є значно більша швидкість процесу.