5

Раздел: « физиология микробов »

Занятие 6. Дата ____________. Тема: «Принципы культивирования бактерий. Выделение и идентификация чистых культур бактерий. Культивирование анаэробов. Дезинфекция, антисептика, стерилизация и асептика. Микрофлора воды и воздуха»

Классификация питательных сред

Группа питательных сред	Жидкие	Плотные
Основные (простые)
Простые среды	Мясо-пептонный бульон (МПБ)	Мясо-пептонный агар (МПА)
Специальные (сложные)
А. Сложные специальные	Сахарный МПБ для стрептококков и др.	Сахарный МПА 5% кровяной агар и др.
Б. Элективные или избирательные (преимущественно растет определенный вид микроорганизмов, другие не растут или растут плохо)	1% щелочная пептонная вода для холерного вибриона 10% желчный бульон для сальмонелл и др.	Желточно-солевой агар (ЖСА) для стафилококков Свернутая сыворотка для дифтерийной палочки Кровяной агар с ванкомицином для бактероидов и др.
В. Среды обогащения (всегда жидкие; используются для накопления микробов определенного вида)	Селенитовый бульон для дизентерийной палочки 10% желчный бульон для сальмонелл и др.	________
Г. Дифференциально-диагностические (применяются для первичной дифференциации бактерий преимущественно по биохимическим свойствам, а также для идентификации бактерий)	Среды Гисса (“пестрый ряд” для определения сахаролитической активности бактерий)	Среда Эндо Среда Левина Среда Плоскирева Среды Гисса (полужидкие) и др.
Д. Хромогенные (всегда плотные; применяются для дифференциации бактерий по культуральным свойствам)	________	«Уриселект^ТМ » и др.
Е. Транспортные (для доставки исследуемого материала в лабораторию)	Среда Стюарта и др.	Среда Стюарта (полужидкая) и др.
Синтетические
	--------	Среда Сотона

К ультивирование анаэробов (метод Фортнера)

Аэробы Анаэробы

Методы стерилизации и аппаратура

Стерилизуемый материал	Метод стерилизации	Режим стерилизации
Инфекционный материал	Автоклавирование	1,5-2 атм., 131^оС, 20-25 мин.
Среды, не содержащие веществ, разлагающихся при 120^оС Бактериальные фильтры	Автоклавирование	1 атм., 120^оС, 20 мин.
Среды, не выдерживающие нагревания до 120^оС Мембранные фильтры	Автоклавирование	0,5 атм., 110^оС, 15-30 мин.
Среды, не выдерживающие нагревания выше 100^оС	Дробная стерилизация	Текучий пар, 60^оС, 3 раза по 30-40 мин., через сутки
Свернутая сыворотка, яичные среды	Аппарат Коха	До 65^оС 3 раза по 45 мин., через сутки
Питательные среды и вещества, разрушающиеся при нагревании	Фильтрование через стерильные бактериальные фильтры: фильтры Зейтца, свечи Шамберлана или Беркефельда	Фильтрование
Колбы, пробирки, чашки Петри, пипетки и прочая стеклянная посуда и инструменты	Печь Пастера	165-170^оС, 45 мин.

Протокол “ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ”

(бактериологический метод исследования)

1 ЭТАП. Посев исследуемого материала на чашки Петри с плотной питательной

средой (МПА) методом штриха. Инкубация при 37^оС в течение 24 часов.

Примечание 1: в том случае, если в исследуемом материале содержится незначительное количество возбудителя (например, в крови), то его предварительно накапливают путем посева материала в жидкую питательную среду (см. среды обогащения), а затем после инкубации (как правило, при 37^оС в течение 18-24 часов) производят пересев на плотную среду.

Примечание 2: выделение и идентификация чистой культуры анаэробов производится в анаэробных условиях.

2 ЭТАП. Идентификация выделенной чистой культуры (чистых культур) по

культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам. Для

этого проводят:

а) макро- и микроскопическое исследование колоний, выросших на плотной

питательной среде (культуральные свойства);

б) приготовление мазка из половины колонии каждого вида и окраску препарата

по Граму (морфологические и тинкториальные свойства);

Примечание: микроскопия материала из колоний производится также с целью проверки чистоты культуры.

в) пересев оставшейся части колонии на скошенный агар для накопления

выделенной чистой культуры. Инкубация при 37^оС в течение 24 часов.

Схема описания колоний

№	Размеры	Форма	Цвет	Поверхность	Края	Консистенция	Структура	Морфология; Окраска по Граму	Предполагаемый возбудитель
1
2

3 ЭТАП.

А. Идентификация выделенной чистой культуры бактерий по биохимическим,

антигенным и др. свойствам.

Для этого производят следующие исследования:

а) изучение однородности роста на скошенном МПА;

б) приготовление, окраска мазка по Граму (или фуксином) и микроскопия для

проверки чистоты выделенной на скошенном МПА культуры;

в) изучение биохимической активности бактерий: посев выделенной чистой культуры на среды Гисса (для определения сахаролитической активности), желатин и МПБ с индикаторными бумажками на индол, аммиак и сероводород (для выявления протеолитической активности). Инкубация при 37^оС в течение 24 часов.

Примечание 1: изучение биохимических свойств проводят только при работе с чистой культурой бактерий. При этом определяют свойства каждого выделенного микроорганизма в отдельности. Если при микроскопии мазка из материала со скошенного МПА обнаруживается смесь бактерий, то процедуру выделения чистой культуры бактерий необходимо повторить.

Примечание 2: для адекватной оценки биохимической активности бактерий необходимо исследовать не менее 15-20 тестов!

Ферментативные свойства бактерий

Предполагаемый возбудитель	САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА					ПРОТЕОЛИТИ-ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
	Лактоза	Глюкоза	Мальтоза	Маннит	Сахароза	Индол	H2S

г) изучение антигенных свойств выделенных бактерий (будет проводиться в разделе: «ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ»).

Б. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.

Инкубация при 37^оС в течение 24ч.

В. Внутривидовая идентификация выделенной чистой культуры бактерий (эпидемиологическое маркирование). Проводится часто с целью определения источника инфекции. С этой целью применяют фаготипирование, рестрикционный анализ, определение плазмидного профиля бактерий и др. исследования.

4 ЭТАП. Учет результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств бактерий, выделенных из исследуемого материала, можно сделать вывод об их принадлежности к виду __________________________ и виду ____________________________________.