- •В ведение
- •Глава 1 гели для электрофореза полиакриламидныи гель (пааг) Исходные материалы
- •Процесс полимеризации пааг
- •Выбор концентраций мономеров
- •Агароза
- •Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная пааг
- •Глава 2 техника приготовления гелей и аппаратура
- •Вертикально расположенные трубки
- •Вертикально расположенные пластины
- •Горизонтально расположенные пластины
- •Глава 3 электрофорез белков
- •Замечания общего характера Миграция белков в геле
- •Напряженность электрического поля (н)
- •Выбор буфера рабочего геля
- •Выделение тепла при электрофорезе
- •Загрузка геля. Ширина белковых зон
- •Введение мочевины и -меркаптоэтанола. Некоторые артефакты
- •Лидирующие красители
- •Разделение белков по размерам и заряду
- •Выбор рабочего буфера
- •Использование мочевины
- •Загрузка геля и подготовка препарата
- •Некоторые примеры
- •Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
- •Разделение белков по размеру с использованием ддс-Na Существо метода
- •Выбор пористости геля
- •Присутствие мочевины и неионных детергентов
- •Выбор рабочего буфера геля
- •Подготовка белкового препарата
- •Проведение электрофореза
- •Окрашивание и элюция белков
- •Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis)
- •Градиент пористости пааг
- •Двумерный электрофорез в пааг
- •Электрофорез с использованием тритона х-100 и цетавлона Тритон х-100
- •Цетавлон
- •Окрашивание белков в пааг
- •Кислые красители
- •Другие красители и методы окрашивания
- •Флюоресцентные красители
- •Локализация ферментов после электрофореза
- •Локализация белковых полос осаждением ддс-Na
- •Элюция белков из геля
- •Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг
- •Счет радиоактивности в элюатах белка
- •Растворение пааг
- •Импрегнирование сцинтиллятора в гель
- •Авторадиография
- •Флюорография
- •Препаративныи электрофорез белков
- •Оглавление
- •Глава 1
- •Глава 2
- •Глава 3
- •Глава 4
- •Глава 1 . Основные понятия теории седиментации ............ 175
- •Глава 2 Ультрацентрифуга ..................... 177
- •Глава 3 Роторы и пробирки .................... 182
- •Глава 4 Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199
- •Глава 5
Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг
Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио- активности белков, а также способы оценки эффективности этих методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы оценки радиоактивности белков после их электрофореза в ПААГ.
Счет радиоактивности в элюатах белка
Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по- мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной, поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля при таком подходе носит более или менее приближенный харак- тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением белкового раствора.
Один из специфических вариантов счета радиоактивности элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового препарата. В нем используется способность комплекса белок— ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас- твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату бел- ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра- ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ. Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос- ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис- пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп- лексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].
Для качественного определения радиоактивности 14С и 125I белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм) можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно- сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].
109
Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю- чает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные 10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры .сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег- да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку- лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].
Растворение пааг
Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по- вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода. Если белки мечены 14С, то к раствору Н2О2 следует добавить NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный 14СО2. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в такой смеси при 65° в течение 4—6 ч и далее просчитывать ра- диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз- можность артефактов — тушения и хемолюминесценции — вы- ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного растворения геля в Н2О2 с NH4OH иногда предпочитают исполь- зовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радио- активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat- zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в 30%-ной Н2О2 с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил- лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз- ванием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелоч- ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле- дяной уксусной кислоты.
Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю- билизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60— 65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при ана- логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New Eng- land Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать 3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион- ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель на- бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец, недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий 6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10X hydroxide» в 1 л то- луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера- туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].
Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето- дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-
110
шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари- тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе- ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в то- луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято- ра MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Solue- ne 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав- ляет около 60%, а выход достигает 90—95%.
Полное растворение геля легко осуществить в том случае, когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла- ве 1 уже был назван в этом качестве NN/-диaллилтapтapдиaмид (ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте растворимого геля используют NN/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи- ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4 при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976] утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос- производимыми характеристиками, чем при использовании ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил- цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида [Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в -меркаптоэтаноле за 2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон- костей, которые необходимо учитывать во избежание образова- ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта- нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN/-Бисакрилилцистамин в настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и ДОЭБА.
Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори- мые ПААГ не получили широкого распространения — скорее всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы, но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло- жить до следующей главы.