3.4.2. Влияние внутриселезеночной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы на функциональное состояние селезенки

В работах DuToit D.F. и соавторов показано, что АлТц фрагментов ПЖ в пульпу селезенки собак может сопровождаться осложнениями, такими как субкапсулярная гематома и перфорации, образование интраспленального некроза, артериальный тромбоз, что приводит к быстрой потере графта и нарушению функции селезенки в организме реципиента [163]. До конца неизученным остается вопрос о том, приводит ли трансплантация ОПЖ неонатальных поросят к повреждению селезенки, нарушению её функции и развитию воспалительных процессов в организме реципиента. Вследствие этого мы считали необходимым оценить показатели, характеризующие функциональное состояние селезенки, на протяжении 91 суток после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Известно, что селезенка принимает участие в формировании гуморального и клеточного иммунитета, в элиминации из кровотока и разрушении стареющих или поврежденных форм эритроцитов и тромбоцитов, в депонировании крови и накоплении тромбоцитов (до 1/3 общего их числа в организме), а также выполняет кроветворную функцию [5, 39, 87].

Одной из наиболее важных функций селезенки является фильтрационная. Фагоциты селезенки элиминируют из организма стареющие или поврежденные формы эритроцитов, однако механизм распознавания жизнеспособных клеток и стареющих или дефектных на сегодня полностью не изучен. Вероятно, это связано с биохимическими и биофизическими изменениями, которые характерны для стареющих или поврежденных клеток [103]. Существует предположение, согласно, которому селезенка очищает циркулирующую кровь от клеток, имеющих измененную мембрану. В ретикулоэндотелиальной ткани селезенки происходит удаление из эритроцитов нуклеарных остатков и гранулярных включений (телец Хауэлла – Жолли, телец Гейнца, гранул железа) при отсутствии разрушения самих клеток. Спленэктомия, атрофия селезенки или внутриселезеночный некроз приводят к повышению содержания патологических форм эритроцитов в крови, особенно сидероцитов, представляющие собой эритроциты или эритробласты, содержащие в цитоплазме гранулы негемоглобинового железа в виде гемосидерина и ферретина [87, 104].

В селезенке также происходит деструкция лейкоцитов, но этот механизм изучен недостаточно, так как существуют данные, что лейкоциты в физиологических условиях погибают в легких, печени и небольшая их часть в селезенке. Тромбоциты главным образом разрушаются в печени и в селезенке. После удаления или тяжелого повреждения селезенки в организме развивается тромбоцитоз, который может приводить к внутривенному тромбозу [5, 18, 54].

Следует отметить, что в селезенке происходит не только деструкция и элиминация клеток крови, но и депонирование 30-50% и более циркулирующих тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов, которые в случае необходимости могут быть выброшены в периферическое русло [39, 87].

У плода селезенка принимает активное участие в кроветворении, а у взрослого человека участвует в продуцировании лимфоцитов и моноцитов, являясь основным органом экстрамедуллярного гемопоэза при нарушении кроветворения в костном мозге. Селезенка участвует в регуляции костномозгового кроветворения, что подтверждают факты, согласно которым после удаления нормальной селезенки или её повреждении появляется ретикулоцитоз и в мазках крови обнаруживается большое количество палочкоядерных гранулоцитов. По данным литературы селезенка участвует в задерживании раннего выхождения ретикулоцитов [5, 104].

В связи с вышесказанным спленэктомия или повреждение селезенки в организме приводит к развитию эритроцитоза, лейкоцитоза, тромбоцитоза, ретикулоцитоза и к появлению патологических форм эритроцитов. Следовательно, в нашей экспериментальной работе мы осуществляли анализ этих показателей после внутриселезеночной трансплантации ОПЖ неонатальных поросят с целью определения влияния ксенотрансплантата на функции селезенки.

В наших исследованиях мы использовали группу животных с тотальной спленэктомией в качестве модели для изучения изменений показателей крови при патологии селезенки.

На таблице 8 представлены данные изменения количества клеток в периферической крови после тотальной спленэктомии кроликам с экспериментальным СД 1 типа. На 3 сутки у кроликов после спленэктомии среднее количество эритроцитов в 1,4 раза, лейкоцитов в 1,4 раза, тромбоцитов в 1,9 раза, ретикулоцитов в 9,5 раза превышало значения, установленные для интактных животных. Постепенное снижение количества эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов у спленэктомированных животных отмечалось на 56 сутки посттрансплантационного периода (Таблица 8). Однако на 91 сутки после тотальной спленэктоми количество эритроцитов в 1,2 раза, количество лейкоцитов в 1,3 раза, количество тромбоцитов в 1,5 раза, количество ретикулоцитов в 6,1 раза было выше относительно интактных животных.

При изучении количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов у кроликов после КсТц ОПЖ в селезенку было обнаружено незначительное повышение этих показателей на 3 сутки посттрансплантационного периода (Таблица 8). Однако на 7 сутки после внутриселезеночной КсТц ОПЖ количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови возвращалось к исходным значениям, оставаясь на уровне, установленном для интактных животных, в течение всего последующего периода наблюдения.

Одним из важных показателей повреждения функции селезенки является наличие в крови патологических форм эритроцитов (сидероцитов). У интактных животных и у кроликов после внутриселезеночной КсТц ОПЖ сидероциты обнаружены не были на протяжении всего периода наблюдения.

При исследовании мазков крови сидероциты были обнаружены на 35-91 сутки у спленэктомированных кроликов (Рис. 3.44). Следует отметить, что на 35 сутки постоперативного вмешательства у кроликов с тотальной спленэктомией содержание сидероцитов в периферической крови в среднем составляло 2,8±0,5%, а на 91 сутки – 1,8±0,2% (Таблица 8).

Рис. 3.44. Сидероциты в периферической крови кроликов с тотальной спленэктомией. Ок. 10, об. 40.

Полученные нами данные показали, что показатели периферической крови у спленэктомированных кроликов характеризуются повышением количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, а также появлением в крови патологических форм эритроцитов. После КсТц ОПЖ в селезенку подобных нарушений обнаружено не было, повышение количества клеток крови на 3 сутки посттрансплантационного периода у животных с внутриселезеночным ксенографтом ОПЖ связано с оперативным вмешательством.

Известно, что процесс распада билирубина до биливердина и свободного билирубина начинается в ретикулоэндотелиальной системе селезенки, а затем продолжается в печени [9, 72]. В нашей работе мы исследовали изменение содержания общего билирубина в сыворотке крови кроликов с тотальной спленэктомией и после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Содержание билирубина в сыворотке крови до оперативного вмешательства у кроликов с экспериментальным СД 1 типа было в 1,5 раза выше, чем у интактных животных, и в среднем составляло 14,30±0,35 мкмоль/л. У интактных животных уровень билирубина в сыворотке крови в среднем составлял 9,29±0,61 мкмоль/л (Рис. 3.45).

Н а 3 сутки после проведения внутриселезеночной КсТц ОПЖ наблюдалось постепенное снижение уровня билирубина в сыворотке крови в среднем до 11,83±0,51 мкмоль/л, а на 7 сутки посттрансплантационного периода этот показатель был в пределах нормальных значений. Следует отметить, что на протяжении 91 суток после КсТц ОПЖ в селезенку содержание общего билирубина находилось на уровне интактных животных, при этом содержание глюкозы в крови в среднем составляло 8,41±0,42 ммоль/л (Рис. 3.45).

Рис. 3.45. Содержание билирубина в сыворотке крови животных после тотальной спленэктомии и после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Примечание. * – отличия достоверны между интактной группой и экспериментальными группами животных, p<0,01, линией указан уровень показателя интактного контроля.

У кроликов с тотальной спленэктомией содержание билирубина в сыворотке крови было на достаточно высоком уровне и в среднем составляло 14,92±0,54 мкмоль/л на протяжении 91 суток. Повышенный уровень билирубина в крови животных с тотальной споленэктомией, возможно, связан с развитием гемолиза эритроцитов, что происходит в результате ускоренного оборота эритроцитов в организме. Необходимо отметить, что спленэктомированные животные были с экспериментальным СД 1 типа, уровень глюкозы у них в среднем составлял 22,05±0,27 ммоль/л, что также способствовало повышению уровня билирубина в крови.

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) является показателем наличия в организме воспалительной реакции. Основные факторы, оказывающие влияние на агрегацию эритроцитов - это поверхностная энергия клеток, заряд клеток и диэлектрическая постоянная, характерные для плазмы и связанные с концентрацией ассиметричных молекул. Увеличение количества в плазме крови ассиметричных крупнодисперсных белков (фибриноген, иммуноглобулины, парапротеины) способствует повышению прочности связей между эритроцитами, что приводит к агглютинации эритроцитов, их слиянию и увеличению СОЭ. Крупнодисперсные белки обладают меньшим – зарядом, адсорбируясь на отрицательно заряженных эритроцитах, они снижают их поверхностный заряд и способствуют быстрой агломерации, что приводит к увеличению СОЭ [23, 65, 199].

Однако в некоторых литературных источниках встречаются данные, согласно которым болезни обмена веществ (сахарный диабет и тиреотоксикоз) сопровождаются повышением СОЭ, нарастающей параллельно выраженности интоксикации и распада тканей и может нормализоваться после применения успешной терапии [8, 48].

Кроме того, известно, что селезенка принимает участие в обмене белков и в ней происходит синтез альбумина, глобина (белкового компонента гемоглобина), фактора VIII свертывающей системы крови [5, 87], а её удаление может привести к белковым сдвигам в организме.

Согласно вышесказанному при изучении влияния внутриселезеночной КсТц ОПЖ на функцию селезенки мы считали необходимым оценить такие показатели как СОЭ, уровень гемоглобина, время свертывания крови.

У интактных животных СОЭ на протяжение всего периода наблюдения составляла 1,7±0,2 мм/час. Следует отметить, что до оперативного вмешательства СОЭ у кроликов с экспериментальным СД 1 типа в 1,5 раза превышала значения интактных животных и в среднем составляла 2,9±0,4 мм/час. После КсТц ОПЖ в селезенку на 3 сутки отмечалось повышение СОЭ до 3,3±0,3 мм/час, однако на 7 сутки наблюдалось снижение данного показателя до значений, установленных для интактных животных, оставаясь в пределах этих значений на протяжении последующего периода наблюдения (Рис. 3.46).

У кроликов с экспериментальным СД 1 типа после спленэктомии на 3 сутки отмечалось резкое повышение СОЭ, которое превышало контрольные значения в 3,5 раза и в среднем составляло 6,5±0,5 мм/час. На 7 сутки у спленэктомированных кроликов наблюдалось постепенное снижение СОЭ, но в течение последующего периода этот показатель в 2,3 раза превышал значения интактных животных (Рис. 3.46). На 91 сутки СОЭ у этой группы животных в среднем составляла 3,4±0,2.

Полученные нами данные изменения СОЭ у кроликов с экспериментальным СД 1 типа после КсТц ОПЖ дали возможность сделать заключение о том, что внутриселезеночный ксенографт ОПЖ способствует нормализации этого показателя, что обусловлено антидиабетическим эффектом.

Повышение СОЭ у кроликов с экспериментальным СД 1 типа после тотальной спленэктомии свидетельствует про наличие сдвига в белковом обмене, являясь следствием удаления селезенки и присутствия в организме экспериментальных животных СД 1 типа.

Рис. 3.46. Изменение скорости оседания эритроцитов у животных после тотальной спленэктомии и после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Примечание. * – отличия достоверны между интактной группой и экспериментальными группами животных, p<0,01, линией указан уровень показателя интактного контроля.

При изучении содержания гемоглобина в крови экспериментальных животных после внутриселезеночной КсТц ОПЖ не было обнаружено достоверных отличий относительно интактной группы животных (Рис. 3.47). Уровень гемоглобина у интактных животных в среднем составлял 128,29±1,85 г/л, а у кроликов после введения ОПЖ в селезенку – 127,29±1,36 г/л на протяжении всего периода наблюдения. На 3 сутки у животных после тотальной спленэктомии наблюдалось снижение в 1,7 раза уровня гемоглобина в крови относительно значений, установленных для интактных животных, а на 35 сутки у спленэктомированных кроликов наблюдалось незначительное повышение уровня гемоглобина в крови. К 91 суткам послеоперативного вмешательства уровень гемоглобина у спленэктомированных кроликов в 1,3 раза был ниже (Рис. 3.47), чем у интактных животных и животных с внутриселезеночным ксенографтом ОПЖ и в среднем составлял 95,28±1,87 г/л.

Рис. 3.47. Изменение уровня гемоглобина у животных после тотальной спленэктомии и после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Примечание. * – отличия достоверны между интактной группой и экспериментальными группами животных, p<0,01, линией указан уровень показателя интактного контроля.

Из литературных данных известно, что нормальное содержание гемоглобина в крови кроликов находится в пределах 72 – 142 г/л [42]. Полученные нами результаты показали, что после спленэктомии уровень гемоглобина находится в границах нормальных значений, однако этот показатель был ниже значений, установленных для контрольных животных. Это дало возможность предположить, что спленэктомия приводит к частичному нарушению процессов синтеза глобина в организме животных.

Исследование времени свертывания крови у кроликов на 3 сутки после КсТц ОПЖ показало снижение данного показателя в 2,5 раза относительно значений, установленных для интактных кроликов, что было связано с оперативным вмешательством. На 7 сутки у кроликов с ксенографтом ОПЖ в селезенке показатель времени свертывания крови восстанавливался до уровня контроля и в среднем составлял 3,5±0,5 минут, а на 14 сутки – 3,9±0,1, оставаясь в пределах этих значений в течение последующего периода наблюдения (Рис. 3.48). У интактных животных время свертывания крови на протяжении 91 суток в среднем составляло 4,0±0,2 минут.

Рис. 3.48. Изменение времени свертывания у животных после тотальной спленэктомии и после внутриселезеночной КсТц ОПЖ.

Примечание. * – отличия достоверны между интактной группой и экспериментальными группами животных, p<0,01, линией указан уровень показателя интактного контроля.

При изучении времени свертывания крови у спленэктомированных животных было отмечено на 3 сутки снижение в 2,9 раза данного показателя относительно контрольной группы животных, что связано с увеличением количества тромбоцитов и оперативным вмешательством (Рис. 3.48). На 63 сутки у сплеэктомированных животных наблюдалось постепенное увеличение времени свертывания крови, однако до исходных значений этот показатель не восстанавливался и на 91 сутки в среднем составлял 3,3±0,1 минуты. Возможно, сниженный показатель времени свертывания крови у спленэктомированных кроликов связан с нарушением синтеза некоторых белковых факторов свертывания крови, который протекает в селезенке, а также с развитием тромбоцитоза [5, 18, 54].

Одним из показателей нарушения функции селезенки является развитие гиперспленизма [5]. Для этого мы изучали массу селезенки интактных животных и животных после КсТц ОПЖ в селезенку, при этом мы не получили достоверных отличий. Масса селезенки у контрольной группы животных в среднем составляла 1,63±0,42 г, а у группы кроликов с внутриселезеночным ксенотрансплантатом ОПЖ - 1,61±0,34 г.

Таким образом, анализ биохимических показателей и параметров крови, которые отражают функциональное состояние печени и селезенки, показал отсутствие нарушений функции этих органов после интрапортальной и внутриселезеночной трансплантаций ОПЖ неонатальных поросят.

Следовательно, интрапортальная и внутриселезеночная КсТц ОПЖ имеют выраженный антидиабетический эффект и не вызывают нарушения функции селезенки и печени, и могут быть использованы в качестве альтернативного способа компенсации экспериментального СД 1типа.

По результатам данного раздела 3.4. опубликованы следующие работы:

1. Биохимические показатели крови у кроликов с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа после интрапортальной трансплантации островков поджелудочной железы / Колот Н.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. // Матеріали науково-практичної конференції: VII Данилевські читання „Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи”. –м. Харків, 2008. – С. 81-82.

2. Ксенотрансплантація острівців підшлункової залози в селезінку при експериментальному цукровому діабеті / Колот Н.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. // Всеукраїнський медичний журнал молодих вчених «Хист». – м. Чернівці, 2008. – С. 212.

3. Показатели крови при ксенотрансплантации островков поджелудочной железы кроликам с аллоксан – индуцированным диабетом / Колот Н.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. // Проблемы криобиологии. – г. Харьков, 2008. – С.

4. Изучение динамики содержания инсулина и показателей углеводного обмена после внутриселезеночной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы / Божок Г.А., Колот Н.В., Бондаренко Т.П., Легач Е.И. // Материалы IV Всероссийского съезда трансплантологов посвященный памяти О.О. Шалимова. – г. Москва, 2008. – С.

5. Влияние интрапортальной и внутрипечёночной ксенотрансплантации островеов поджелудочной железы на функциональное состояние печени / Колот Н.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. // Проблеми ендокринної патології. – 2008. – № . – С. .

6. Внутриселезёночная трансплантация островков Лангерганса как метод лечения сахарного диабета 1 типа / Божок Г.А., Колот Н.В., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. // Трансплантологія. – 2008. – Т. , № . – С..