Сохранение организмов и клеточных культур
Необходимость сохранения и восстановления генетических ресурсов дикорастущих растений способствовала принятию в 1992 г. в Рио-де-Жанейро международной Конвенции по сохранению биологического разнообразия (ратифицирована Россией в 1995 г.). Глобальная стратегия по сохранению растений была принята на Шестой встрече в рамках Конференции Сторон по Конвенции о биологическом разнообразии, проведенной в Гааге в 2002 г. В связи с этим в «Стратегию ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (Москва, 2002 г.) был включен раздел об организации банков семян и вегетативно размножаемых форм растений.
Наиболее полноценно генофонд дикорастущих видов сохраняется в природных популяциях на охраняемых территориях — в заповедниках, национальных парках, ботанических садах и т. д. Однако этих традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений уже давно недостаточно из-за присущих им ограничений.
Одним из эффективных способов сохранения живых объектов, в том числе микроорганизмов и культур клеток, является поддержание их в коллекциях, о которых еще недавно было распространено представление как о месте «складирования» хаотическим образом собранных штаммов. Сейчас же коллекции находятся в эпицентре научных исследований, поскольку содержат не только культуры, но и значительные объемы полезной научной информации. Во многих странах мира наблюдается Ренессанс коллекционного дела, и коллекции приобретают все большую ценность. Нельзя забывать и о том, что их наличие является необходимым условием развития биотехнологии во всех промышленно развитых странах. Например, устойчивое функционирование > крупных национальных коллекций микроорганизмов необходимо для исследовательских и прикладных целей. В то же время содержание коллекции — это трудоемкое и дорогостоящее дело. Согласно подсчетам, стоимость создания и сохранения в течение 25 лет коллекции из 3 тыс. микроорганизмов составляет 4 млн долларов США.
Во многих странах создаются национальные программы по сохранению природного богатства генетических фиторесурсов, и обязательным их компонентом является создание банков зародышевой плазмы (germplasm): семян, меристем, пыльцы, зародышей, культур тканей и клеток и другого генетического материала. Долговременное хранение геномов (зародышевой плазмы) позволяет собрать и сохранить без потери жизнеспособности генетически полноценное морфологическое, физиолого-биохимическое, адаптационное богатство природной внутривидовой изменчивости.
Одна из актуальных задач современной эволюционной биологии заключается в создании системы генетических стандартов. Это связано с тем, что каждый генотип может эволюционировать при наличии не менее 80-90 % объема генетической информации.
Возникла также необходимость надежного сохранения в неизменном состоянии штаммов тканей и клеток, являющихся продуцентами веществ народнохозяйственного значения. Это вызвано тем, что клеточные штаммы используют вместо природного растительного сырья на биотехнологических заводах, и создание банка продуцентов, хранящихся необходимый промежуток времени в биологически полноценном состоянии, оградит производство от риска их потери.
В настоящее время разработана биотехнология для поддержания и хранения генофонда ценных видов растений. Ее основой являются методы культивирования in vitro клеток, тканей, меристем, зиготических и соматических зародышей растений. Однако это довольно трудоемкий процесс, поскольку требует значительных затрат ручного труда, энергии и реактивов. В связи с этим учеными разрабатываются технологии, способствующие снижению экономических затрат. К их числу можно отнести:
замедление роста объектов;
сушку;
криосохранение.
Для замедления роста объектов служат следующие способы:
хранение под слоем минерального масла (применяют для бактериальных и грибных культур, иногда — для клеточных культур высших растений);
изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда;
изменение светового режима;
охлаждение до температуры прекращения активного роста;
использование гормональных (для растительных клеток часто применяют хлорхолинхлорид) и осмотических (маннит в концентрации 3-6 %) ингибиторов;
замена в питательных средах СаС12 на Ca(NO3)2;
индукция клубнеобразования в пробирках (позволяет сохранить генофонд, например картофеля).
Сушка, применяемая для сохранения объектов, может быть проведена в вакуумсушильных шкафах, в распылительной сушилке, которая позволяет пневматически распылять раствор до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха.
Наиболее часто используют лиофильную сушку. Метод лиофилизации основан на том, что температура кипения поды при давлении 4,6 мм рт. ст. составляет 0 °С, а при давлении 0,034 мм рт. ст. понижается до -50 °С. При этой температуре вода замерзает, и поэтому процесс упаривания представляет собой типичную возгонку.
Принцип проведения лиофильной сушки весьма прост. Водный раствор полностью замораживают в тонком слое и выдерживают в вакууме при давлении 0,01-2 мм рт. ст. Благодаря быстрому испарению воды, замороженный раствор постоянно охлаждается. Удаляемые водяные пары улавливают в охлаждаемых ловушках или с помощью поглотителей. Таким способом можно полностью высушить продукт за пару часов.
Основные преимущества метода лиофильной сушки состоят в том, что:
в процессе упаривания объект находится при низкой температуре. Это особенно важно для обезвоживания белков, антибиотиков, вирусов, микроорганизмов и нестабильных фармацевтических продуктов;
лиофилизация не сопровождается вспениванием;
во время всей операции объект находится при низкой температуре, следовательно, нет опасности его микробиологического разрушения, а ферментативное расщепление сведено до минимума;
нет опасности окисления нестабильных веществ кислородом воздуха, поскольку работу проводят при относительно глубоком вакууме;
полученные объекты содержат около 0,5 % влаги, благодаря чему их можно хранить длительное время, не опасаясь разрушения или заражения.