Лимоннокислое брожение

Плесени в процессе дыхания также окисляют углеводы не­редко не до СО₂ и Н₂О, поэтому в среде накапливаются про­дукты неполного окисления — различные органические кислоты (щавелевая, янтарная, яблочная, лимонная и др.). Образование грибами лимонной кислоты применяют в промышленности.

Лимоннокислым брожением называется окисление глюкозы грибами в лимонную кислоту. Конечный результат брожения можно представить следующим суммарным уравнением:

2С₆Н₁₂0₆ +30₂ -> 2С₆Н₈0₇ + 4Н₂0.

Химизм образования лимонной кислоты из сахара до настоя­щего времени окончательно не установлен. Большинство иссле­дователей считает, что это брожение до образования пировино-градной кислоты протекает, как и другие брожения. Далее пре­вращение пировиноградной кислоты в лимонную через ряд кислот (уксусную, янтарную, фумаровую, яблочную, щевелево-уксусную) сходно с превращениями в цикле Кребса.

Раньше лимонная кислота добывалась из цитрусовых пло­дов — лимонов и апельсинов. Этот способ очень невыгоден, так как плоды содержат только 7—9% лимонной кислоты.

В настоящее время ее получают главным образом путем бро­жения ¹. Технические приемы биохимического получения лимон­ной кислоты в СССР были разработаны В. С. Буткевичем и С. П. Костычевым.

Возбудителем брожения является гриб Aspergillus niger.

Основным сырьем служит меласса — черная патока. Раствор ее, содержащий около 15% сахара, в который добавляют необ­ходимые для гриба питательные ^вещества (в виде различных минеральных солей), наливают 'невысоким (8—12см) слоем в плоские открытые сосуды (кюветы) и засевают спорами гриба. Кюветы помещают в бродильные камеры, которые хорошо аэри-

¹ Лимонную кислоту для технических целей получают путем переработки отходов табака и махорки.

руются. Процесс продолжается 6—8 дней при температуре около 30° С. Гриб развивается на поверхности сбраживаемой жидкости. Выход лимонной кислоты достигает 60—70% израсхо­дованного сахара. По окончании брожения раствор из-под пленки гриба сливают. Лимонную кислоту выделяют из рас­твора и подвергают очистке и кристаллизации. При отсутствии в растворе сахара эта кислота может быть окислена грибом до более простых продуктов — щавелевой и уксусной кислот, углекислого газа и воды.

Описанный «поверхностный метод» (гриб развивается на поверхности сбраживаемого субстрата) получения лимонной кислоты заменяется в настоящее время «глубинным методом», при котором мицелий гриба растет в закрытых чанах (фермен­таторах) в толще высокого слоя сбраживаемой жидкости, не­прерывно перемешиваемой и аэрируемой стерильным воздухом. Этот способ повышает производительность труда, позволяет из­бежать заражения сбраживаемого субстрата посторонними микроорганизмами, его легче автоматизировать и механизи­ровать.

Лимонная кислота используется в кондитерской промышлен­ности, производстве безалкогольных напитков, сиропов, кулина­рии и медицине.

ПРЕВРАЩЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВ

Гнилостные процессы

В метаболизме микроорганизмов азотсодержащие вещества подвергаются разнообразным превращениям. По внешнему сходству разные виды порчи пищевых продуктов нередко назы­вают гниением. Однако гниение — это процесс глубокого разложения белковых веществ микроорганизмами.

Способность разрушать в той или иной степени белковые ве­щества свойственна многим микроорганизмам. Некоторые раз­лагают непосредственно белки, другие могут воздействовать только на более или менее простые продукты распада белковой молекулы, например на пептиды, аминокислоты и др.

Разложение белков микроорганизмами связано с использо­ванием их для синтеза веществ тела, а также в качестве энер­гетического материала. Одни микроорганизмы вызывают неглу­бокое расщепление белка, другие ведут более глубокий распад его и образуют при этом более разнообразные продукты.

Химизм разложения белковых веществ. Гниение — сложный, многоступенчатый биохимический процесс, характер которого и конечный результат зависят от строения и состава разлагае­мых белков, условий процесса и видов вызывающих его микро­организмов.

Белковые вещества не могут непосредственно поступать в клетки микроорганизмов, поэтому использовать белки могут только те из них, которые обладают протеолитическими фермен­тами экзопротеазами, выделяемыми клетками в окружающую среду.

Процесс распада белков начинается с их гидролиза. Первич­ными продуктами гидролиза являются пептоны и пептиды. Они расщепляются до аминокислот, которые являются конечными продуктами гидролиза.

Такие белки, как нуклеопротеиды, под действием гнилост­ных микробов расщепляются на белковый комплекс и нуклеино­вые кислоты. Белки затем разлагаются аналогично тому, как описано выше, а нуклеиновые кислоты распадаются на фосфор­ную кислоту, углеводы и смесь азотсодержащих оснований.

Образующиеся в процессе распада белков различные амино­кислоты используются микроорганизмами или подвергаются ими дальнейшим изменениям, например дезаминированию, в резуль­тате чего образуются аммиакⁱ и разнообразные органические соединения в соответствии с характером самих аминокислот и ферментов микроорганизмов. Процесс дезаминирования может происходить различными путями. Различают дезаминирование гидролитическое, окислительное и восстановительное.

Гидролитическое дезаминирование сопровождается об­разованием оксикислот и аммиака. Если при этом происходит и декарбоксилирование аминокислоты, то образуются спирт, ам­миак и углекислый газ:

RCHNH₂COOH + Н₂0 ~> RCHOHCOOH + NH₃;

RCHNH₂COOH + H₂0 -+ RCH₂OH + NH₃ +CO₂.

При окислительном дезаминировании образуются кетокислоты и аммиак:

RCHNH₂COOH +1/2 О_{2 =} RCOCOOH + NH₃.

При восстановительном дезаминировании образуются карбоновые кислоты и аммиак:

RCHNH₂COOH + 2H =RCH₂COOH + NH₃.

Из приведенных уравнений видно, что среди продуктов раз­ложения аминокислот в зависимости от строения их радикала (R) обнаруживаются различные органические кислоты и спирты. Так, при разложении аминокислот жирного ряда могут накап­ливаться муравьиная, уксусная, пропионовая, масляная и другие кислоты, пропиловый, бутиловый, амиловый и другие спирты. При разложении аминокислот ароматического ряда промежуточ­ными продуктами являются характерные продукты гниения: фе­нол, крезол, скатол, индол — вещества, обладающие очень не­приятным запахом. При распаде аминокислот, содержащих серу, получается сероводород или его производные — меркаптаны (на­пример, метилмеркаптан CH₃SH). Меркаптаны обладают запа­хом тухлых яиц, который ощущается даже при ничтожно ма­лых их концентрациях.

Возбудители гниения.

Среди множества микроорганизмов, способных в той или иной мере разлагать белки, особое значе­ние имеют микроорганизмы, которые вызывают глубокий распад белков — собственно гниение. Такие микроорганизмы принято называть гнилостными. Из них наибольшее значение имеют бактерии. Гнилостные бактерии могут быть спорообразующими и бесспоровыми, аэробными и анаэробными. Многие из них мезофилы, но есть холодоустойчивые и термостойкие. Большинство чувствительны к кислотности среды и повышенному содержанию в ней NaCl. Многие способны к сбраживанию углеводов.

Наиболее распространенными и активными возбудителями гнилостных процессов являются следующие: Вас. subtilis (сен­ная палочка) и Вас. mesentericus (картофельная палочка) — аэробные, подвижные, спорообразующие бактерии

Клетки сенной палочки объединяются в более или менее длинные цепочки. Споры этих бактерий отличаются высокой термоустойчивостью. Температурный оптимум развития сенной палочки 37—50° С, максимум роста — около 60° С. Температур­ный оптимум роста картофельной палочки 36—45°С, а максимум — около 50—55° С. При рН 4,5—5 развитие этих бактерий прекращается. Вас. mesentericus обладает более высокой амилоитической и протеолитической активностью, но менее энергично, чем Вас. subtilis, сбраживает сахара.

Сенная и картофельная палочки помимо продуктов, богатых белками, портят пищу, содержащую углеводы (кондитерские из­делия, сахарные сиропы и др.), поражают хлеб (преимущест­венно пшеничный), клубни картофеля. Вас. mesentericus вызы­вает побурение мякоти ко­сточковых плодов (абрикосов, персиков). Оба вида широко распространены в природе и способны вырабатывать анти­биотические вещества, подав­ляющие развитие многих бо­лезнетворных и сапрофитных бактерий.

Нитрификация

Процесс последовательного окисления аммиака до азотистой и азотной кислот называется нитрификацией, а вызывающие его бактерии — нит­рифицирующими. Сущность этого процесса была раскрыта и изучена С. Н. Виноградским.

Работами С. Н. Виноградского установлено, что процесс нитрификации происходит в две фазы, каждая из которых обусловлена деятельностью спе­цифических аэробных бактерий. Возбудители первой фазы — нитрозные бактерии — окисляют аммиак до солей азотистой кислоты (нитритов). Возбудители второй фазы — нитратные бактерии — окисляют соли азотистой кислоты в соли азотной кислоты (нитраты

Процесс нитрификации представляет собой яркий пример метабиоза, когда одни микроорганизмы начинают развиваться после других на продук­тах жизнедеятельности первых.

Нитрифицирующие бактерии относятся к типичным хемосинтезирующим автотрофам; они очень чувствительны к наличию в среде органических соеди­нений. Эти бактерии живут в почве, природных водах.

Очень важное значение имеют нитрификаторы в сельском хозяйстве. Образующийся в почве при разложении белков аммиак, хотя и усваивается растениями в виде аммонийных солей, но лучшим источником азотистого пи­тания для растений являются нитраты, которые и накапливаются в почве в результате деятельности нитрифицирующих бактерий. Часто эти бактерии встречаются в условиях, где жизнь на первый взгляд кажется невозможной, например на гранитах и голых скалах. Здесь они участвуют в выветривании горных пород благодаря разрушающему действию образуемой ими азотной кислоты. Развиваясь на кирпичных стенах зданий, нитрифицирующие бакте­рии могут разрушать кирпичную кладку. Немалая роль принадлежит им, по-видимому, и в разрушении подводных частей бетонных сооружений.

Денитрификация

Процесс восстановления нитратов до молекулярного азота называется денитрификацией, а бактерии, осуществляющие его, — денитри­фицирующими.

Эти бактерии являются факультативными анаэробами. Нитраты они вос­станавливают в анаэробных условиях, когда в процессе дыхания при окис­лении органических веществ используют кислород нитратов в качестве акцеп­тора водорода. В аэробных условиях денитрификаторы обычно не восстанав­ливают нитраты, так как в процессе дыхания используют свободный кисло­род. Большинство денитрифицирующих бактерий имеют палочковидную форму, спор не образуют, но есть и спороносные палочки, а также микро­кокки.

Денитрифицирующие бактерии широко распространены в природе, они встречаются в почве, природных водах, навозе и т. д. Деятельность денитри­фицирующих бактерий может нанести большой ущерб плодородию почвы, особенно при плохой аэрации, так как под их влиянием азот нитратов, ус­ваиваемый растениями, переходит в неиспользуемый ими свободный азот.

Известны и другие процессы восстановления нитратов. Многие сапрофит­ные микроорганизмы (различные бактерии и грибы) обладают способностью восстанавливать нитраты лишь до нитритов.

В пищевой промышленности восстановление микробами нитратов до нит­ритов может происходить при изготовлении колбас, сосисок, ветчины. Розовая окраска таких продуктов получается вследствие соединения нитрита с крася­щим веществом мяса миоглобином. Для придания продукту розово-красного цвета в рассол добавляют нитриты или нитраты. Нитраты сначала восста­навливаются находящимися в продукте бактериями в нитриты, а последние вступают во взаимодействие с миоглобином мясопродуктов.

Фиксация молекулярного азота

Некоторые бактерии способны фиксировать атмосферный (молекуляр­ный) азот, т. е. переводить его в связанное состояние. Они восстанавливают азот до аммиака; часть его используется самими микроорганизмами, а часть выделяется в окружающую среду.

Одни азотфиксирующие (азотусваивающие) бактерии живут свободно в почве и воде; другие — в симбиотическом сожительстве с растениями, пре­имущественно бобовыми. Бактерии поселяются в бородавчатых вздутиях — клубеньках корней этих растений. Отсюда произошло и название этих бак­терий — клубеньковые. Энергию, необходимую для фиксации бактерии получают в процессе окисления безазотистых органических соеди­нений, которые они берут из клеток корней растений.

Величина и форма клубеньковых бактерий значительно изменяются в за­висимости от их возраста и условий жизни. Молодые клетки — мелкие под­вижные палочки —не образуют спор. По мере развития клетки теряют жгу­тики, становятся искривленными, утолщенными или ветвистыми; эти формы клубеньковых бактерий называются бактероидами.

Среди свободно живущих азотфиксирующих бактерий наибольшее значе­ние имеет аэробная бактерия Azotobacter chroocaccum, имеющая форму слегка приплюснутых кокков, часто объединенных попарно; клетки имеют слизистую

капсулу.

Из анаэробных свободно живущих азотусваивающих бактерии следует отметить бактерию, открытую С. Н. Виноградским (1893 г.), — Clostndium pasteurianum. Это подвижные спорообразующие палочки, способные сбражи­вать углеводы по типу маслянокислого брожения, которое и служит бакте­риям источником энергии для связывания молекулярного азота.

Азотфиксирующие бактерии имеют важное значение для сельского хо­зяйства. За счет их деятельности постоянно пополняются азотистые запасы почвы, что способствует ее плодородию.

В практике сельского хозяйства препараты из азотфиксирующих ( рий используются в качестве бактериального удобрения: азотобактерин-из культур азотобактера, нитрагин —из культур клубеньковых бактерий

ПРЕДМЕТ, ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ, ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнология - это наука об использовании биотехнологических процессов в технике и промышленном производстве.

К числу биологических процессов относят те, в которых применяют биологические объекты различной природы (микробной, растительной или животной). Биотехнология как наука формировалась и развивалась по мере развития человеческого общества. Возникновение и развитие биотехнологии можно подразделить на 4 периода:

• эмпирический;

• этиологический;

• биотехнический;

• генотехнический.

Эмпирический (доисторический период) - самый длительный, который охватывает около 600 млн. лет до н.э. н около 2000 лет н.э. Древние породы интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и других продуктов которые сейчас относим к биотехнологическим процессам. Переходы после охотничьего кризиса к оседланному образу жизни привели к изобретению техники земледелия. Стали формироваться первичные цивилизации Месопотамии, Египта, Индии и Китая. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. Уже в 14 веке - начали приготавливать уксус "Орлеанским способом", водку из хлебных злаков получили в 16 веке, шампанское известно с 18 века. Абсолютный этанол впервые удалось получить в 14 веке испанцу Раймунду, благодаря перегонке вина с негашеной известью. Продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Так в ассирийской столице еще в 8-7- веке до н.э. царская библиотека насчитывала более 30 000 табличек клинических из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре.

К этому периоду относятся: получение кисломолочных продуктов, квашенной капусты, силосование кормов. К этому периоду также относятся большое накопление фактов в области микологии (о грибах), которая стала самостоятельной наукой.

Второй период (этиологический) охватывает период с 1856-5933 гг. Связан с исследованиями фр. ученого Луи Пастера.

Его достижения в биотехнологии: - открыл микробную природу брожжений; предложил метод стерилизации; создал научные основы вакцинопрофилактики; приготовил в 1859 г. первую жидкую питательную среду.

В этот период были обнаружены ряд вирусов:

- вирус мозаичной болезни табака (Ивановский Д.И.). И.П.Фрош открыл вирус ящура, были открыты вирус желтой лихорадки, вирусы бактерий (бактериофаги).

В этот период удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, и некоторых продуктов обмена (метаболизма) - ацетона, бутанола, лимоновой и молочной кислот. Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.

Третий период (биотехнологический) начался с 1933 г. С опубликования работы Клюйвера и Перкина "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные технические приемы. С этого периода началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, которое обеспечивало проведение процессов в стерильных условиях. Мощный толчок в развитии промышленного биотехнологнческого оборудования был отмечен в период развития производства антибиотиков.

В 1950 г. Ж.Моно (Франция) разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования микробов. Примерно за 40 лет этого периода были решены основные задачи по созданию и внедрению в практику необходимого оборудования - биореакторов.

Четвертый период (генотехнический) начался с 1972 г. В этом году П.Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК.

В !982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, которые несут в себе искусственно встроенную генетическую информацию об этом гормоне. Зная строение аппарата наследовательности у разных организмов, удается манипулировать как нуклеиновыми кислотами, так и целыми хромосомами (клеточная инженерия) и клетками (клеточная инженерия). Для этого периода характерны: создание необычных организмов, ранее не существовавших в природе (неклубеньковых растений, несущих гены азотобактерий, ответственные за способность фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внедрение экологически чистых, безотходных технологий, разработка и внедрение в практику спец. аппаратуры и др.

Отрасли биотехнологии:

• медицинская биотехнология;

• иммунобиотехнология;

• инженерная энцимология;

• биогеотехнология.

К медицинской биотехнологии относятся ее производственные процессы, которые завершаются созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицинского назначения - антибиотики, ферменты, коферменты.

Иммуно-биотехнология - объединяет производства вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуномедиаторов.

Биогеотехнология - сущность ее сводится к использованию микроорганизмов для добычи полезных ископаемых (цветная руда, нефти и др.).

Инженерная энцимология - базируется на использовании каталитических функций ферментов в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения целевых продуктов.