Вопрос 1 История развития геномных исследований

Первое представление о геномах сложилось в начале XX века с открытием законов генетики, формулировкой хромосомной теории наследственности и построение первых генетических карт.

Первые методы исследования геномов, включая секвенирование ДНК, были разработаны в 60-70 годы XX века

В 1986 было предложено автоматическое секвенирование. Отличие от ручного являетося то, что получаются не радиоактивные , а флуоресцентные результаты.

Автоматическое секвенирование значительно повысило скорость расшифровки геномных последовательностей и позволило инициировать первые геномные проекты

Наличие автоматических секвенаторов позволило секвенировать геном человека

1995 –расшифровка генома для первого организма

1999 –расшифрован геном мухи. Опубликован « черновик « генома человека

В последние несколько лет опубликованы первые результаты работ в направлении синтетическая геномика :

• Хим. Синтез бактериального генома

• Его клонирование в дрожжевой клетке

• Трансплантация в бактериальную клетку др. вида

Разделы геномики :

1. Структурная – структура генома ( из чего состоят)

2. Функциональная – ф-и геномных последовательностей

3. Биоинформатика

4. Палогеномика

5. Популяционня

6. Медицинская

№2 Геномные проекты

Ограниченные возможности методов секвенирования ДНК предопределяют дополнительные шаги , необходимые для определения последовательности геномов:

• Конструирование геномынх библиотек – источник фрагментов ДНК

• Картирование генома

• Секвенирование отобранных из библиотек клонов

• Компактная сборка последовательности генома из полученных коротких фрагментов ДНК

• Финиширование : секвенирование оставшихся пробелов

• Аннтотация геномной последовательности

Существует 2 подхода к секвенированию геномов

1. Иерархический ( клон за клоном)

• Конструирование геномных библиотек

• Отбор коллекции перекрывающихся клонов + физическое картирование

• Секвенирование отобранных клонов

• Аннтотация генома

2. Шотган ( метод дробовика)

• Конструирование геномных библиотек

• Массовое секвенирование случайных клонов

• Комп-я сборка перекрывающихся участков секвенированных фрагментов

• Финиширование : секвенирование оставшихся пробелов

• Аннотация генома

Недостатки и достоинства : 1) кол-во получаемой послед-ти выше при иерархическом подходе

2) трудоемкость и стоимость ниже при шотган подходе

3) секвенаторы 2 поколения –автоматически предусматривают исп-е шотган подхода

Векторы, используемые в геномных проектах :

Плазмиды – высококопийные плазмиды используются в качестве основных источников

Фаговые векторы

Космиды – содержат cos –сайт фага , сайт инициации репликации в E. Сoli, ген антибиотикорезистентности

Искусственные хромосомы –линейные фрагменты ДНК, которые несут 3 сост. части

№ 3 Картирование геномов на сегодняшний день – единственный способ, который гарантирует высокое качетсво определямых последовательностей, не укорачивая никаких кусков генома

Задача 1) определить относительное расположение каких-то определенных участков на хромосом Задача2) отпределить расстояние между ними

Современные методы картирования : 1) Генетическое картирование

Генетические маркеры :

• Ген ( фенотипический маркер) – используются такие гены, инактивация которых имеет фенотипическое проявление ( проявление генотипа в фенотип)

• RFLP ( полиморфизм длин рестрикиционных фрагментов) –это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикций ( расщепляют нукл. К-ты в середине ) и дальнейший анализ образовавшихся фрагментов ( рестриктов) путем гель-электрофореза

Полиморфизм – это аллели конкретного участка ДНК. Как правило, это либо нуклеотидная замена, либо небольшая инсерция или делеция.

• SSLP ( полиморфизм длин простых повторов)- Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2,3,4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше.

С минисателлитами (это повторы до 25 н.п.) не совсем понятно, каким образом они генерируются. Одна из моделей предполагает, что они таким же образом получаются

• SNP (Полиморфизм по одиночным нуклеотидам) – отличия последовательности ДНК размеров в 1 нуклеотид в геноме представителя одного вида

НЕДОСТАТКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КАРТИРОВАНИЯ : 1) ограниченная разрешающая способность

1. Ограниченная аккуратность из-за неравномерности кроссинговера и экспериментальных ошибок

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ

1. Первый шаг в построении полной карты состоит в представлении генома в виде упорядоченного набора рестрикционнх фрагментов ДНК ( использование рестриктаз, распознающих 7-8 нуклеотидов; а сайт которых входят редкие комбинации нуклеотидов)

2. FISH ( флуоресцентная гибридизация) - Методика флюоресцентной гибридизации на препаратах позволяет непосредственно локализовать на хромосомной карте интересующий Вас локус. Проблема методики флюоресцентной гибридизации:1) низкая разрешающая способность

3. STS –картирование ( для sts картирования нужны : sts –маркеры, набор многократно перекрывающихся фргаментов ДНК)

STS-маркеры –это короткие фрагменты ДНК

№ 4 Конструирование геномных библиотек значит конструирование тех фрагментов ДНК , что используются для секвенирования . Существует 2 варианта конструирования этих библиотек :

• In Vivo –характерно для методик I поколения, ПРЕИМУЩЕСТВА: библиотеки созданные in vivo можно использовать и для др. вещей , например в картировании геномов

Относят иерархический подход

• In vitro -характерно для методик II поколения, удобнее использовать

Относят шотган –подход

При конструировании геномных библиотек используют фаговые и плазмидные вектора:

Плазмиды

1. рUC. 90% сиквенсов делается на этой плазмиде.

2. В очень редких случаях берется какой-то другой вектор, но такого же типа – небольшая высококопийная бактериальная плазмида. Используется она, т.к. это высококопийная плазмида, присутствует в клетке до 1000 копий, ее легко выделить и концентрация ее в препарате высокая, поэтому легко очищать.

Недостатки, связанные с высокой копийностью:

1. Некоторые фрагменты геномной ДНК в принципе невозможно клонировать в таких плазмидах, т.к. даже нормальный клеточный ген может оказаться токсичным для клетки.

2. В такие векторы нельзя клонировать протяженные фрагменты ДНК длиной больше нескольких т.н.п.

Фаговые векторы

У них всегда больше емкость; Считается, что фаговые векторы замещения достаточно стабильны, и их до сих пор используют в крупных геномных проектах, когда нужно закрыть пробелы, которые никак не клонируются в других библиотеках.

3. Недостатки:

ДНК фага выделять гораздо менее удобно (сложнее методика, гораздо более трудоемко, автоматизировать сложнее). Поэтому фаговые векторы обычно используются на стадии финиширования, когда нужно закрыть пробелы.

• Следующий по емкости – космидный вектор. Это гибрид плазмиды и бактериофага

• Следующие по времени разработки векторы – это дрожжевые искусственные хромосомы. Эти векторы специально разработаны под проект «Геном человека». Искусственные хромосомы – линейный фрагмент ДНК, который должен нести 3 составных части. Как правило, такая дрожжевая хромосома имеет точку инициации репликации плазмид, для того чтобы нарабатывать ДНК в бактериях.

• искусственные хромосомы на основе фага Р1. Это крупный фаг, более 100 т.н.п. В клетке он существует в виде плазмиды, не встраиваясь в хромосому. Может быть лизогенным. Это природная плазмида, рассчитанная на подержание достаточно крупного репликона.

№6 Метод Сэнгера

Многие методы секвенирования ДНК основаны на взаимной комплиментарности цепей этой молекулы

1. перед секвенированием по методу Сэнгера молекулу разрезают на фрагменты и клонируют в E. Coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амлифицируются с помощью полимеразной цепной реакции ( ПЦР)

2. ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры, при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют dNTP т праймер – короткий олигонуклеотид , комплиментарный небольшому сегменту ДНК –матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом и ДНК-полимерраза последовательно присоединяет у его концу dNTP, комплиментарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяется пока не получат миллионы копий каждого фрагменты

3. Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют в 4 пробирки, в каждую из которых добавлены 4 разные dNTP и один из флуоресцентно меченых ddNTP. Удлинение гибридизовавшегося праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP

4. Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определенной длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце , так что на выходе получаеся цветная картинка , которую можно транспортировать в нуклеотидную последовательность

Применение метода СЭнгера в настоящий момент ограничено высокой трудоемкостью. Основные причины высокой трудоемкости:

• Использование электрофореза для регистрации продуктов реакции

• Необходимость создания библиотеки клонов для секвенирования

• Необходимость выделения и очистки ДНК из большого числа клонов

(Метод Сэнгера попроще)

Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Сэнгер использовал ДНК- полимеразу 1. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК- дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (d NTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок- затравка, с которого начинается синтез. Были также синтезированы модифицированные дезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3’-ОН отсутствует, для каждого из 4 оснований ДНК. ДНК- полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации. Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность, которой надо определить, короткого фрагмента «меченой» ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырёх ddNTP и соответствующего dNTP в строго определённом соотношении( чтобы они конкурировали), а также остальных трёх dNTP. Готовят четыре смеси каждая из которых содержит один из четырёх ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченных фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включён дефектный нуклеотид. Полученные меченные фрагменты ДНК разделяют в полиакриломидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырёх пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК.

№ 7

Основные принципы секвенаторов II поколения

• Max автоматизация

• Полный отказ от электрофореза

• Только флуоресцентные метки

• Миниатюризация и параллелизация реакций

• Секвенируемые фрагменты короче, но в большем кол-ве

Для реакции пиросеквенирования :

• длина читаемой последовательности 400 н.п

• кол-во одновременных реакций 1.25 млн

• рабочий цикл 6 часов

• кол-во оснований в сутки 1.25 млрд

Метод пиросеквенирования ДНК з основан на многошаговой детекции неорганического пирофосфата, образующегося из dNTP или ddNTP в процессе присоединения ДНК-полимеразой соответствующего нуклеотидмонофосфата к 3’-концу растущей цепи ДНК, иммобилизованного на твердом носителе

Технология пиросеквенирования включает :