№1.

Предмет, цели и задачи цитологии, ее место в системе биологических наук.

Цитология – это наука, которая изучает строение, функции, индивидуальное развитие и эволюцию клеток. Термин “цитология” образован из двух греческих слов: китос – сосуд и логос – наука. Как самостоятельная наука цитология сформировалась к концу XIX в. В 1884 г. вышла книга французского ученого Жана Батиста Карнуа “Биология клетки”, в которой был обобщен накопленный к этому времени материал и дано обоснование трех основных задач микроскопического исследования живых организмов  общей, сравнительной и специальной биологии клетки или цитологии. Эту дату и можно считать началом самостоятельного развития цитологии.

Как каждая самостоятельная наука, цитология имеет собственный предмет, методы и теоретическую основу. Предметом цитологии является клетка, основным методом исследований – микроскопия, а теоретической основой – клеточная теория. Поэтому на формирование цитологии наибольшее влияние оказали такие события, как изобретение микроскопа(Галилей,1609), открытие клетки(Р.Гук 1665) и создание клеточной теории(1839,Шванн).

Цитология занимает центральное положение в ряду биологических дисциплин, т.к. клеточные структуры лежат в основе строения, функционирования и индивидуального развития всех живых существ, и, кроме того, она является составной частью гистологии животных, анатомии растений, протистологии и бактериологии.

№2

Изобретение микроскопа и открытие клетки. Первые результаты микроскопического изучения строения живых организмов (Р. Гук, М. Мальпиги, Н. Грю, А. Левенгук). Открытие клеточного ядра. Научные школы Я. Пуркине и И. Мюллера.

Первый микроскоп был сконструирован итальянским физиком Г. Галилеем в 1609 г. как модификация созданного им ранее телескопа. Однако с конца 16в. стали широко использоваться микроскопы, состоявшие из одной двояковыпуклой линзы небольшого диаметра. Именно таким прибором пользовался открывший простейших голландец А. Левенгук (16321723).

Первым человеком, увидевшим клетки, был английский учёный Роберт Гук .В 1665 году, пытаясь понять, почему пробковое дерево так хорошо плавает, Гук стал рассматривать тонкие срезы пробки с помощью микроскопа. Он обнаружил, что пробка разделена на множество крошечных ячеек,и он назвал эти ячейки клетками (cell «ячейка»). В 1674 году голландский мастер Антоний ван Левенгук с помощью микроскопа впервые увидел в капле воды инфузории, амёб и бактерии. Также Левенгук впервые наблюдал животные клетки — эритроциты и сперматозоиды. В 1802—1808 годах французский исследователь Шарль-Франсуа Мирбель установил, что все растения состоят из тканей, образованных клетками.Пуркине открыл ядро яйцеклетки птиц, а в 1839 ввёл термин «протоплазма». В 1831 году английский ботаник Р. Броун впервые описал ядро растительной клетки, а в 1833 году установил, что ядро является обязательным органоидом клетки растения. С тех пор главным в организации клеток считается не мембрана, а содержимое.

Клеточная теория строения организмов была сформирована в 1839 году немецким зоологом Т. Шванном и включала в себя следующие положения:

• Как растения, так и животные состоят из универсальных микроскопических структур – клеток.

• Сходство растительной и животной клеток вытекает из общих принципов их строения и размножения.

• Каждая клетка самостоятельна в своей жизнедеятельности.

• Организм представляет собой совокупность большого числа клеток.

В 1878 году русским учёным И. Д. Чистяковым открыт митоз в растительных клетках; в 1878 году В. Флемминг и П. И. Перемежко обнаруживают митоз у животных. В 1882 году В. Флемминг наблюдает мейоз у животных клеток, а в 1888 году Э. Страсбургер — у растительных.

Одной из школ где изучалось микроскопическое строение животных тканей, была лаборатория Мюллера в Берлине. Мюллер изучал микроскопическое строение хорды,его ученик Генле опубликовал исследование о кишечном эпителии, в котором он дал описание различных его видов и их клеточного строения. Здесь были выполнены исследования Шванна, заложившие основание клеточной теории.

Пуркинье основал в Бреславле свою школу,где со своими учениками выявил строение тканей и органов млекопитающих. Он сравнивал отдельные клетки растений с клетками животных что дало возможность ввести понятия «аналогия» и «гомология» в современном смысле.

№3.

Основные положения клеточной теории Т. Шванна. Развитие клеточной теории после Т. Шванна. Р. Вирхов и его «Клеточная патология». Выделение цитологии в самостоятельную науку.

Клеточная теория строения организмов была сформирована в 1839 году немецким зоологом Т. Шванном и включала в себя следующие положения:

• Как растения, так и животные состоят из универсальных микроскопических структур – клеток.

• Сходство растительной и животной клеток вытекает из общих принципов их строения и размножения.

• Каждая клетка самостоятельна в своей жизнедеятельности.

• Организм представляет собой совокупность большого числа клеток.

Шванн пытался рассматривать организм как сумму клеток. Эта тенденция получает особое развитие в «Клеточной патологии» Вирхова. Работы Вирхова оказали неоднозначное влияние на развитие клеточного учения:

Клеточная теория распространялась им на область патологии, что способствовало признанию универсальности клеточного учения. Труды Вирхова привлекли внимание к протоплазме и ядру, признанными наиболее существенными частями клетки. Вирхов дополнил важнейшим положением клеточную теорию -всякая клетка происходит от другой клетки.

Шлейден и Шванн, обобщив имеющиеся знания о клетке, доказали, что клетка является основной единицей любого организма. Клетки животных, растений и бактерии имеют схожее строение. Позднее эти заключения стали основой для доказательства единства организмов. Т. Шванн и М. Шлейден ввели в науку основополагающее представление о клетке: вне клеток нет жизни.

В 1930-х годах советский биолог Лепешинская, основываясь на данных своих исследований, выдвинула «новую клеточную теорию». В её основу было положено представление, что в онтогенезе клетки могут развиваться из некоего неклеточного живого вещества,но критическая проверка фактов, положенных Лепешинской не подтвердила данных о развитии клеточных ядер из безъядерного «живого вещества».

Современная клеточная теория включает следующие положения:

• Клетка- элементарная единица живого

• Клетки разных организмов гомологичны по своему строению

• Размножение клеток происходит путем деления исходной клетки

• Многоклеточные организмы это сложные ансамбли клеток, объединенные в системы тканей и органов, подчиненные и связанные между собой гуморальной и нервной регуляцией

Понимание универсальности клеточного строения живых организмов явилось одним из главных факторов развития цитологии и других биологических наук.

№4.

Физические и химические методы фиксации материала для микроскопического исследования

Фиксация-важнейший этап в приготовлении препарата. Она применяется для сохранения прижизненного строения клеток и тканей и предназначена для инактивации ферментов лизосом.

Различают химические(с помощью реактивов) и физические (замораживание,нагревание,высушивание,микроволновая обработка) способы фиксации.

В гистологии чаще используют химические способы или замораживание. В качестве химических фиксаторов широко используют простые фиксаторы (10% формалин, 70-96% спирт) и сложные фиксаторы(смеси различных веществ,например спирта, хлороформа, уксусной кислоты, на основе пикриновой кислоты). Продолжительность фиксации зависит от размеров объекта и используемого фиксатора

Общие требования к фиксаторам

• Фиксаторы должны работать быстро.

• Не должны вызывать деформацию тканей или делать их хрупкими.

• Должны переводить клеточное содержимое в состояние, нерастворимое в воде и других жидкостях, использующихся при дальнейшей обработке препарата.

• Не вызывает затемнение препарата, а, напротив, способствует его просветлению.

• Не образует в клетках артефактов фиксации.

• Не препятствует окраске препарата выбранным методом. Это особенно актуально при использовании иммуногистохимических методов окраски; к примеру, при использовании обычного формалина антигенные структуры зачастую выявить не удается, в таких случаях рекомендуется использовать нейтральный формалин.

№5.

Основные цитологические и гистологические красители и механизм их взаимодействия с клеточными структурами.

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.

Красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель — эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет.Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными — базофильными.

Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.

Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с препаратами.

Так же применяются и другие красители: Орсеин,талуидиновый синий,железистый гематоксилин,импрегнация Ag,О5О4,пикриновая кислота+фуксин,AgNO3,тионин+пикриновая кислота

№6.

Устройство светового микроскопа, его разрешающая способность и увеличение. Формула Аббе. Апертура объектива.

Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Разрешение микроскопа по полю (d)- это минимальное расстояние между двумя точками формируемого им изображения, пока они еще видны

Микроскоп состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. Увеличение оптического микроскопа без дополнительных линз между объективом и окуляром равно произведению их увеличений между объективом и окуляром формировалось действительное, увеличенное и перевернутое изображение препарата.

чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). различают полезное и бесполезное увеличение.Полезное увеличение,это увеличение без потери качества

Формула Аббе: d=061 λ/NA

Где: d-разрешение микроскопа

λ-длинна волны используемого света

NA – численная апертура объектива

Численная апертура объектива характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны

№7.

Специальные методы световой микроскопии: темнопольная, поляризационная, люминесцентная, интерференционная микроскопия. Фазово-контрастная микроскопия.

Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для темнопольной микроскопии используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Препарат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. В качестве иммерсионной жидкости пригодно вазелиновое масло.

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. В люминесцентном микроскопе свет от источника проходит через два фильтра. Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом.

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой — мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы.

№8.

Иммуноцитохимия. Принцип метода и его применение в цитологии и гистологии.

Имуноцитохимия- специфическая окраска определенного белка в фиксированных клетках при помощи флуоресцентно меченных антител

Иммуноцитохимический метод выявления поверхностных маркеров лимфоцитов основан на специфичности иммунологической реакции антиген-антитело и чувствительности световой микроскопии. Для выявления антигена на клетке использованы немеченые антитела, а образующийся иммунный комплекс выявлен с помощью антител, конъюгированных с ферментом-меткой. Использование одного фермента пероксидазы создавало возможность выявления на клетке только одного антигена. Для реализации этого метода на подготовленные предметные стекла наносят суспензию мононуклеаров, полученную путем градиентного центрифугирования.

Основное отличие иммуноцитохимии от иммуногистохимии состоит в

том, что исследования проводятся на цитологических мазках, а не на гистологических

срезах. Таким образом, используется нативный материал, что делает антигены более

доступные для взаимодействия с антителами.

Применяют для выявления раковых клеток

№9.

Устройство и принцип работы электронного микроскопа. Разрешающая способность и увеличение электронного микроскопа. Особенности подготовки материала для электронной микроскопии.

Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

в микроскопе имеются две оптические системы. Первая из них включает в себя источник света, коллектор с полевой диафрагмой и конденсор с апертурной диафрагмой. Назначение этой системы  равномерно освещать препарат. Вторая система состоит из препарата, объектива и окуляра. Объектив выполняет прямое преобразование Фурье, а окуляр  обратное преобразование Фурье, проецируя с помощью хрусталика изображение объекта на сетчатку глаза. Параллельный ход лучей обеспечивается в микроскопе между конденсором и препаратом, а также между объективом и окуляром. Математически диффракция световой волны на круглом отверстии описывается прямым преобразованием Фурье

Разрешение микроскопа по полю (d)- это минимальное расстояние между двумя точками формируемого им изображения, пока они еще видны. чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение, это увеличение без потери качества

Препараты для электронной микроскопии должны быть очень тонкими, не толще 0,1 u, так как иначе будут поглошаться проходящие через препарат электронные лучи. Это обусловливает особую технику изготовления тонких препаратов. Большое применение имеет способ нанесения взвеси на тонкую органическую пленку, которая служит в этом случае «предметным стеклом». Пленки изготовляются из 0,5—1,5% раствора коллодия в амилацетате.

Если каплю такого раствора опустить на поверхность воды, то капля растекается по поверхности и после испарения амилацетата остается тончайшая пленка толщиной в 0,01—0,001 u, через которую электронные лучи проходят почти без поглощения. На металлический диск диаметром 2—4 мм и с отверстием в центре 0,05—0,1 мм или на диски из мелкой металлической сетки (до 100 отверстий на 1 мм2) вылавливают коллодиевую пленку. Исследуемый объект наносят на пленку в виде взвеси или тончайшего среза.

Каплю соответствующей взвеси проволочной петлей или пипеткой наносят на пленку. После испарения жидкости на пленке остается тонкий слой исследуемого объекта.

10) Химический состав биомембран. Сэндвич-модель биомембраны. Мозаичная модель строения биомембраны. Морфология мембраны в электронном микроскопе. Типы подвижности молекул в биомембране.

Все биомембраны построены одинаково; они состоят из двух слоев липидных молекул толщиной около 6 нм, в которые встроены белки. Некоторые мембраны содержат, кроме того, углеводы, связанные с липидами и белками. Соотношение липиды : белки : углеводы является характерным для клетки или мембраны и существенно варьирует в зависимости от типа клеток или мембран.

Компоненты мембран удерживаются нековалентными связями, вследствие чего они обладают лишь относительной подвижностью, т. е. могут диффундировать в пределах липидного бислоя. Текучесть мембран зависит от липидного состава и температуры окружающей среды. С увеличением содержания ненасыщенных жирных кислот текучесть возрастает, так как наличие двойных связей способствует нарушению полукристаллической мембранной структуры. Подвижными являются и мембранные белки. Если белки не закреплены в мембране, они «плавают» в липидном бислое как в жидкости. Поэтому говорят, что биомембраны имеют жидкостно-мозаичную структуру.

В то время как «дрейф» в плоскости мембраны происходит достаточно легко, переход белков с внешней стороны мембраны на внутреннюю («флип-флоп») невозможен, а переход липидов происходит крайне редко. Для «перескока» липидов необходимы специальные белки транслокаторы. Исключение составляет холестерин, который может легко переходить с одной стороны мембраны на другую.

11.Особенности строения плазматической мембраны растительных и животных клеток. Транспорт веществ через плазмалемму. Эндоцитоз.

Плазмолемма (цитолемма, плазматическая мембрана) создает селективный барьер между клеткой и внешней средой. Состоит из двух электронноплотных слоев, между которыми находится электроннопрозрачный слой. Плазмолемма, отграничивая содержимое клетки от внешней среды, одновременно обеспечивает избирательный обмен веществ между клеткой и средой. Пассивный транспорт не требует затрат энергии. Активный транспорт осуществляется с затратой энергии. Важная роль в клетке принадлежит встроенным в плазмолемму белкам-рецепторам. Их центры связывания располагаются на по-верхности плазмолеммы, обеспечивая восприятие лигандов  молекулярных сигналов, посылаемых другими клетками.

Ф-ии: межмембранный транспорт молекул и надмолекулярных комплексов; межклеточные коммуникации; распознавание других клеток и образование клеточных комплексов; поддержание размеров и формы клетки, а также ее активное передвижение; распознавание компонентов межклеточного вещества и прикрепление к ним;

Разновидность активного транспорта связана с пространственными преобразованиями плазмолеммы и включает эндоцитоз, обеспечивающий транспорт макромолекул в клетку, и экзоцитоз, который осуществляет выведение веществ из клетки. Процессы эндоцитоза и экзоцитоза сбалансированы таким образом, что площадь поверхности плазмолеммы обычно остается постоянной.

Эндосомы являются одномембранными органоидами, которые обеспечивают эндоцитоз

разновидности эндоцитоза  фагоцитоз, пиноцитоз и специфический эндоцитоз.Фагоцитоз - поглощение клеткой твердых веществ.Пиноцитоз-захват клеткой мелких капель воды с растворенными в ней веществами.обеспечивается пиносомой.Специфический эндоцитоз -

поглощение клеткой молекулярных комплексов “лиганд-рецептор” и транспорт их в пластинчатый комплекс.обеспечивается опушенными везикулами.