№1 Предмет вирусология. Х-а разделов

Вирусология — раздел микробиологии, изучающий вирусы. Наука о вирусах (субмикроскопических внутриклеточных паразитах)

В самостоятельную дисциплину была выделена лишь в середине ХХ века.

Вирусы вездесущи.

Основоположник Ивановский (мозаичная болезнь табака) – 1892 год.

Общая вирусология. Изучает основные принципы строения, размножения вирусов, их взаимодействие с клеткой-хозяином, происхождение и распространение вирусов в природе. Один из важнейших разделов общей вирусологии — молекулярная вирусология, изучающая структуру и функции вирусных нуклеиновых кислот, механизмы экспрессии вирусных генов, природу устойчивости организмов к вирусным заболеваниям, молекулярную эволюцию вирусов.

Частная вирусология исследует особенности определенных групп вирусов человека, животных и растений и разрабатывает меры борьбы с вызываемыми этими вирусами болезнями.

Молекулярная вирусология изучает структуру и функции вирусных нуклеиновых кислот, механизмы экспрессии вирусных генов, природу устойчивости организмов к вирусным заболеваниям, молекулярную эволюцию вирусов.

№2 История открытия. Периоды. Происхождение

История открытия вирусов: Вирусы - мельчайшие организмы, их размеры колеблются от 12 до 500 нанометров. Мелкие вирусы равны крупным молекулам белка. Вирусы - резко выраженные паразиты клеток.

1892 Ивановский открыл возбудителя мозаичной болезни табака которая может проходить через фильтры, задерживающие бактерии. Позднее эти результаты были подтверждены М. Бейеринком, предложившим для инфекционного начала термин «вирус » (1899). Основным стимулом к формированию вирусологии как самостоятельной науки явилось открытие Ф. Туортом (1915) и Ф. Д'Эреллем (1917) вирусов бактерий, или бактериофагов (разрушение гнойного стафилококка перевиваемым фильтрующимся агентом). Многие методы работы с бактериофагами и возникшие при этом концепции были затем использованы для изучения вирусов растений и животных. Исследования химического состава вирусных частиц были начаты в 1930-х гг., после того как У. Стэнли (1935) выделил чистый препарат вируса табачной мозаики в виде кристаллов. В 1930-50-х гг. были разработаны методы культивирования вирусов, а для изучения структуры вирусных частиц были применены электронная микроскопия и рентгеноструктурный анализ. Дальнейшее развитие вирусологии тесно связано с успехами молекулярной генетики: установлена генетическая роль вирусных ДНК (А. Херши, М. Чейз, 1952) и РНК (А. Гирер, Г. Шрамм, 1956), открыты явления самосборки вирусных частиц из РНК и белка (X. Френкель-Конрат, 1955), интерференции вирусов (А. Айзеке и Дж. Линденман, 1957), РНК-зависимого синтеза ДНК, т. е. обратной транскрипции (X. Темин и Д. Балтимор, 1970-80-е гг.) и др. Современная вирусология подразделяется на общую и частную. Общая вирусология изучает основные принципы строения, размножения вирусов, их взаимодействие с клеткой-хозяином, происхождение и распространение вирусов в природе.

Периоды: 1) Начался с исследований Иановского

2) Связан с изобретением электрического микроскопа.

Быстрый прогресс в области вирусологических знаний, основанный в значительной мере на достижениях смежных естественных наук, обусловил возможность углубленного познания природы вирусов. Как ни в одной другой науке, в вирусологии прослеживается быстрая и четкая смена уровней познания — от уровня организма до субмолекулярного. Быстрый прогресс в области вирусологических знаний, обоснованный в значительной мере на достижениях смежных естественных наук, обусловил возможность углубленного познания природы вирусов. Как ни в одной дру-гой науке, в вирусологии прослеживается быстрая и четкая смена уровней познания – от уровня организма до субмолекулярного. Приведенные периоды развития вирусологии отражают те уровни, которые являлись доминирующими в течение одного – двух десятилетий. (30-40-е годы XX века). Основной экспериментальной моделью являются лабораторные животные (белые мыши, крысы, кроли-ки, хомяки и т.д), основным модельным вирусом – вирус гриппа. В 40-е годы в вирусологию в качестве экспериментальной модели прочно входят куриные эмбрионы в связи с их высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы и некоторым другим. Использование этой модели ста-ло возможным благодаря исследованиям австралийского вирусолога и имму-нолога Ф. М. Бернета, автора пособия по вирусологии «Вирус как организм». Открытие в 1941 г. американским вирусологом Херстом феномена ге-магглютинации немало способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой еа модели вируса гриппа и эритроцитов. Большим вкладом отечественных вирусологов в медицинскую вирусо-логию явилось изучение природно-очаговых заболеваний – эпидемических энцефалитов. В 1937 г. была организована первая экспедиция, возглавляемая Л. А. Зильбером, в составе которой были Е. Н. Левкович, А. К. Шубладзе, М. П. Чумаков, В. Д. Соловьев и другие. Благодаря проведенным исследова-ниям был открыт вирус клещевого энцефалита, выявлены его переносчики - иксодовые клещи, разработаны методы лабораторной диагностики, профи-лактики и лечения. Советскими вирусологами были изучены вирусные ге-моррагические лихорадки, разработаны препараты для диагностических и лечебно-профилактических целей. (50-е годы). В 1949 г происходит значительное собы-тие в истории вирусологии – открытие возможности культивировать клетки в искусственных условиях. В 1952 г. Дж. Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс полу-чили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Исполь-зование культуры клеток в вирусологии явилось подлинно революционным событием, послужившим основой для выделения многочисленных новых ви-русов, их идентификации, клонирования, изучения их взаимодействия с клеткой. Появилась возможность получения культуральных вакцин. Это воз-можность была доказана на примере вакцины против полиомиелита. В со-дружестве с американскими вирусологами Дж. Солком и А. Сейбином, со-ветскими вирусологами М. П. Чумаковым, А. А. Смородинцевым и другими была разработана технология производства, апробирована и внедрена в прак-тику убитая и живая вакцины против полиомиелита. В 1959 г. была проведе-на массовая иммунизация детского населения в СССР (около 15 млн.) живой полиомиелитной вакциной, в результате резко снизилась заболеваемость по-лиомиелитом и практически исчезли паралитические формы заболевания. В 1963 г. за разработку и внедрение в практику живой полиомиелитной вакци-ны М. П. Чумакову и А. А. Смородинцеву была присуждена Ленинская пре-мия. Другим важным приложением техники выращивания вирусов явилось получение Дж. Эндерсом и А. А. Смородинцевым живой коревой вакцины, широкое применение которой обусловило значительное снижение заболе-ваемости корью и является основой для искоренения этой инфекции. Молекулярный уровень (60-е годы). В вирусологии широко стали ис-пользовать методы молекулярной биологии, а вирусы благодаря простой ор-ганизации их генома стали распространенной моделью для молекулярной биологии. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без ви-русной модели, включая генетический код, весь механизм внутриклеточной экспрессии генома, репликацию ДНК, созревание информационных РНК и т.д. В свою очередь использование молекулярных методов в вирусологии по-зволило установить принципы строения вирусных индивидуумов – вирионов, способы проникновения вирусов в клетку и их репродукцию. (70-е годы). Стремительное развитие моле-кулярной биологии открывает возможности изучения первичной структуры нуклеиновых кислот и белков. Появляются методы секвенирования ДНК, оп-ределения аминокислотных последовательностей белка. Получают первые генетические карты геномов ДНК-содержащих вирусов.

. Д. Балтимором и одновременно Г. Теминым и С. Мизутани была открыта обратная транскриптаза в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов, фермент, переписывающий РНК на ДНК. Становится реальным синтез гена с помощью этого фермента на матрице, вы­деленной из полисом иРНК. Появляется возможность переписать РНК в ДНК и провести ее секвенирование. Возникает новый раздел молекулярной био­логии — генная инженерия. В этом году публикуется со­общение  П.  Берга в  США  о  создании  рекомбинантной молекулы ДНК, которое положило начало эре генной инженерии. Появляется возможность получения большого количества нуклеиновых кислот и белков путем введения рекомбинантных ДНК в состав генома прокариот и прос­тых эукариот. Одним из основных практических прило­жений нового метода является получение дешевых препа­ратов белков, имеющих значение в медицине (инсулин, интерферон) и сельском хозяйстве (дешевые белковые корма для скота).

Этот период характеризуется важными открытиями в области медицинской вирусологии. В фокусе изучения — три наиболее массовых болезни, наносящих огромный ущерб здоровью людей и народному хозяйству,— грипп, рак, гепатит.

Установлены причины регулярно повторяющихся пан­демий гриппа. Детально изучены вирусы рака животных (птиц, грызунов), установлена структура их генома и идентифицирован ген, ответственный за злокачественную трансформацию клеток — онкоген. Установлено, что при­чиной гепатитов А и В являются разные вирусы: гепатит А вызывает РНК-содержащий вирус, отнесенный к се­мейству пикорнавирусов, а гепатит В — ДНК-содержащий вирус, отнесенный к семейству гепаднавирусов. В . Г. Бламберг, исследуя антигены крови у аборигенов Австралии, обнаружил так называемый австралийский ан­тиген, который он принял за один из антигенов крови. Позже было выявлено, что этот антиген является анти­геном гепатита В, носительство которого распространено во всех странах мира. За открытие австралийского анти­гена Г. Бламбергу в . была присуждена Нобелевская премия.

Принято считать, что вирусы произошли в результате обособления (автономизации) отдельных генетических элементов клетки, получивших, кроме того, способность передаваться от организма к организму. В нормальной клетке происходят перемещения нескольких типов генетических структур, например матричной, или информационной, РНК (мРНК), транспозонов, интронов, плазмид. Такие мобильные элементы, возможно, были предшественниками, или прародителями, вирусов.

№3 Струкутра вирусологической лаборатории

Комнаты: 1) Первичного приема (в ней емкости с дезрастворами, емкости для отбросв использованного материала)

2) Предварительной обработки (в ней столы для вскрытия, термостаты, холодидьники, ламинарный бокс)

3) Боксы (холодильники, термостаты). В предбоксниках – стерильная одежда и микросоп

4) Серологическая (наборы посуды)

5) Автоклавная

6) Моечная

7) Микроскопическая

8) Комнаты отдыха. Гардероб. Столовая

9) Виварий

№4 Принципы систематики и классификации вирусов

Основополагающий принцип систематики – тип нуклеиновой кислоты вирионов (вирусная частица, предст собой белковую капсулу). По данному признаку выделяют две группы: 1) ДНК-содержащие 2) РНК-содержащие. Каждая из них подразделяется на семейства (-viridae), подсемейства (-virinae), роды, виды, варианты (типы – по антигенной структуре – серотипы, по генотипу)(-virus).

Критерии систематики вирусов:

1) особенности нуклеиновых кислот:

а) структуры (одно-двухцепочечные, полные-недостроенные, цельные-фрагментированные)

б) конфигурации (линейные-кольцевые)

в) геномной функции («плюс-минус» нитевые)

2) наличие или отсутствие внешней оболочки

3) круг хозяев и антигенная специфичность

4) размеры и морфология вирионов, тип симметрии и число капсомером в капсиде

5) органно-тканевой тропизм вирусов, их ЦПД, способы передачи и распространения.

Класс I: вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК для репликации попадают в ядро клетки, так как им требуется клеточная ДНК-полимераза. Также репликация ДНК этих вирусов сильно зависит от стадии клеточного цикла. В некоторых случаях вирус может вызывать деления клетки, что может приводить к раковому перерождению. Примерами таких вирусов являются Herpesviridae, Adenoviridae и Papovaviridae.

У представителей семейства Poxvirus геномна ДНК реплицируюется не в ядре.

Класс II: вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК Вирусы семейств Circoviridae и Parvoviridae реплицируют геномную ДНК в ядре и в ходе репликации образуют интермедиат — двуцепочечную ДНК.

Класс III: вирусы, содержащие двуцепочечную РНК

Как и большинство РНК-вирусов, представители класса III реплицируют геномную РНК в цитоплазме и используют полимеразы хозяина в меньшей степени, чем ДНК-вирусы. Класс III включает в себя два крупных семейства Reoviridae и Birnaviridae. Репликация моноцистронная, геном сегментирован, каждый ген кодирует один белок.

Классы IV и V: вирусы, содержащие одноцепочечную РНК

Классы IV и V включают вирусы двух типов, репликация которых не зависит от стадии клеточного цикла. Наряду с вирусами, содержащими двуцепочечную ДНК, эти вирусы наиболее изучены.

Класс IV: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК

Непосредственно на (+) геномной РНК вирусов IV класса может идти синтез белка на рибосомах клетки хозяина. Вирусы классифицируют на две группы, в зависимости от особенностей РНК: у вирусов с полицистронной мРНК трансляция приводит к образованию полипротеина, который затем разрезается на зрелые белки. С одной цепи РНК может синтезироваться несколько разных белков, что снижает длину генов. вирусы со сложной транскрипцией содержат субгеномные мРНК, синтез белка идет сосдвигом рамки считывания, также используется протеолитический процессинг полипротеинов. Эти механизмы обеспечивают синтез разных белков с одной цепи РНК.

Примеры вирусов данного класса включают представителей семейств Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Arteriviridae и Togaviridae.

Класс V: вирусы, содержащие одноцепочечную (−)РНК

Геномные РНК вирусов класса V не могут быть транслированы на рибосомах клетки хозяина, предварительно требуется транскрипция вирусными РНК-полимеразами в (+)РНК. Вирусы пятого класса классификации по Балтимору классифицируют на две группы:

вирусы, содержащие несегментированный геном, на первом этапе репликации происходит транскрипция (−)РНК вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразной в моноцистронную мРНК, и далее синтезируются дополнительные копии (+)РНК, служащие матрицами для синтеза геномных (−)РНК. Репликация геномных РНК таких вирусов осуществляется в цитоплазме. вирусы с сегментированными геномами, репликация геномных РНК которых происходит в клеточном ядре, вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует моноцистронные мРНК с каждого сегмента генома. Наибольшим отличием данной группы вирусов от другой группы пятого класса состоит в том, что репликация осуществляется в двух местах.

Представители данного класса входят в состав семейств: Arenaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae и Rhabdoviridaе.

Класс VI: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК Наиболее хорошо изученным семейством данного класса вирусов, являются ретровирусы. Вирусы класса VI используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+)РНК в ДНК. Вместо использования РНК в качестве матрицы для синтеза белков, вирусы этого класса используют матрицу ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина. Наиболее хорошо изученным представителем данной группы вирусов является ВИЧ.

Класс VII: вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК, реплицирующиеся через стадию одноцепочечной РНК

Небольшая группа вирусов, в состав которой входит вирус гепатита В, представитель семейства Hepadnaviridae, имеют двуцепочечную геномную ДНК, которая ковалентно замкнута в форме кольца и является матрицей для синтеза мРНК вируса, а также субгеномных РНК. Субгеномная РНК служит матрицей для синтеза ДНК-генома ферментом обратной транскриптазой вируса.

Таксономическая схема, включающая все виды вирусов, основана на постоянстве биохимических, биофизических и морфологических признаков.

Царство Vira подразделено по признаку природы нуклеиновых кислот, носителей генетического материала вирусной частицы, на 2 подцарства — ДНК- и РНК-содержащие (С. Я. Гайдамович, В. М. Жданов, 1963). РНК может быть одно- или двунитчатой. Дополнительные критерии учитывают молекулярный вес нуклеиновых кислот и их долю в общей массе вириона конфигурацию нуклеиновых кислот (линейная, циркулярная), симметрию нуклеопротеида. Тип симметрии положен в основу подразделения вирусов на классы, а для выделения порядков используется признак наличия или отсутствия внешних оболочек. Разделение вирусов на семейства основывается на величине диаметра нуклеокапсида, числе капсомеров. Согласно классификации, предложенной Временным комитетом по номенклатуре вирусов Международной ассоциации микробиологических обществ (1965), все изученные вирусы подразделяются на 5 классов, 8 порядков и 21 семейство. Вирусы, обитающие в дыхательных путях и вызывающие острые респираторные заболевания, объединены в группу респираторных. По морфологическим признакам, химическому составу и биологическим свойствам они относятся к нескольким семействам: миксовирусы, пикорнавирусы (риновирусы и энтеровирусы), аденовирусы. Каждое семейство состоит из нескольких видов вирусов сходных по ряду основных биологических свойств, но четко различающихся серологически.

№5 Основные свойства вирусов

Вирусы обладают следующими свойствами.

1. Это мельчайшие живые организмы.

2. Они не имеют клеточного строения.

3. Вирусы способны воспроизводиться, лишь проникнув в живую клетку. Следовательно, все они — облигатные эндопаразиты. Иными словами, вирусы могут жить, лишь паразитируя внутри других клеток. Большинство из них вызывает болезни.

4. Вирусы устроены очень просто. Они состоят из небольшой молекулы нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, окруженной белковой или липопротеиновой оболочкой.

5. Они находятся на границе живого и неживого.

6. Каждый тип вируса способен распознавать и инфицировать лишь определенные типы клеток. Иными словами, вирусы высокоспецифичны в отношении своих хозяев.

Вирусы - мельчайшие организмы, их размеры колеблются от 12 до 500 нанометров. Мелкие вирусы равны крупным молекулам белка. Вирусы - резко выраженные паразиты клеток. Важнейшими отличительными особенностями вирусов являются следующие отличия:

1. Они содержат в своем составе только один из типов нуклеиновых кислот: либо рибонуклеиновую кислоту (РНК), либо дезоксирибонуклеиновую (ДНК), - а все клеточные организмы, в том числе и самые примитивные бактерии, содержат и ДНК, и РНК одновременно.

2. Не обладают собственным обменом веществ, имеют очень ограниченное число ферментов. Для размножения используют обмен веществ клетки - хозяина, ее ферменты и энергию.

3. Могут существовать только как внутриклеточные паразиты и не размножаются вне клеток тех организмов, в которых паразитируют.

Вирусы не размножаются на искусственных питательных средах - они чересчур разборчивы в пище. Обычный мясной бульон, который устраивает большинство бактерий, для вирусов не годится. Им нужны живые клетки, и не любые, а строго определенные. Как и другие организмы, вирусы способны к размножению. Вирусы обладаютнаследственностью.. Наследственные признаки вирусов можно учитывать по спектру поражаемых хозяев и симптомам вызываемых заболеваний, а также по специфичности иммунных реакций естественных хозяев или искусственных иммунизируемых экспериментальных животных. Сумма этих признаков позволяет четко определить наследственные свойства любого вируса, и даже больше - его разновидностей, имеющие четкие генетические маркеры, например: нейротропность некоторых вирусов гриппа и т.п. Изменчивость является другой стороной наследственности, и в этом отношении вирусы подобны всем другим организмам, населяющим нашу планету. При этом у вирусов можно наблюдать как генетическую изменчивость, связанную изменением наследственного вещества, так и фенотипическую изменчивость, связанную с проявлением одного и того же генотипа в разных условиях.

№6 Физическая структура вирусов

Просто организованные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и нескольких белков, образующих вокруг неё оболочку — капсид. Примером таких вирусов является вирус табачной мозаики. Его капсид содержит один вид белка с небольшой молекулярной массой. Сложно организованные вирусы имеют дополнительную оболочку — белковую или липопротеиновую; иногда в наружных оболочках сложных вирусов помимо белков содержатся углеводы. Примером сложно организованных вирусов служат возбудители гриппа и герпеса. Их наружная оболочка — это фрагмент ядерной или цитоплазматической мембраны клетки-хозяина, из которой вирус выходит во внеклеточную среду. Для выяснения структуры вирусов исследователи начали разбирать их на части, после чего собирать в единую структуру заново. Хайнц ЛюдвигФренкель-Конрат, работавший вместе с Робли Уильямсом, обнаружил, что после небольшой химической обработки белок вируса табачной мозаики распадается на 2200 фрагментов, представлющих собой пептидные цепи, каждая из которых состояла из 158 аминокислот. В 1960г был установлен аминокислотный состав пептидных фрагментов вирусного белка.

При помещении этих фрагментов в раствор они имели тенденцию к соединению в единую длинную цепь, в виде которой они существовали в исходном вирусе. Фрагменты соединялись благодаря ионам кальция и магния.Фрагменты вирусного белка при воссоединении образуют пространственную геометрическую систему. Так, например, фрагменты белка вируса табачной мозаики, о котором мы только что говорили, образуют сегменты спирали. Шестьдесят фрагментов белка вируса полиомиелита при соединении образуют 12 пятиугольников. Двадцать субъединиц белка вируса радужной долгоножки собираются в правильную жесткую двадцатигранную структуру.

Структура, в которую собираются фрагменты белка вируса, полая внутри. Спираль белка, например, вируса табачной мозаики состоит из 130 оборотов пептидной цепи, образующей внутри длинную прямую полость. Внутри полости, образованной белковым компонентом вируса, находится его нуклеиновая часть -- нуклеиновая кислота, ДНК или РНК. Независимо от того, какой нуклеиновой кислотой представлен нуклеиновый компонент вируса, он всегда состоит из 600 нуклеотидов (правда, Сол Шпигельман обнаружил способную к репликации вирусную РНК, состоящую из 480 нуклеотидов).

№7 Химический состав вирусов

Непременным компонентом вирусной частицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы - входят в состав далеко не всех вирусов.

Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группы паразитирует на животных.

Простые вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и нескольких кодируемых ею полипептидов. Более сложные вирусы обычно содержат также липиды и углеводы; у большинства родов вирусов эти компоненты не кодируются вирусным геномом, а имеют клеточное происхождение. В исключительных случаях в вирусную частицу оказываются включенными клеточные нуклеиновые кислоты или полипептиды.

Вирусы содержат только один вид нуклеиновой кислоты — либо ДНК, либо РНК. Вирусные нуклеиновые кислоты бывают одно- и двухцепочечными, а вирусный геном может состоять из одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, и если он состоит из одной молекулы, она может быть линейной или кольцевой. Метилирование нуклеиновых кислот вирусов животных до сих пор не обнаружено, не были обнаружены и минорные азотистые основания, которые содержатся в ДНК вирусов бактерий или в транспортных РНК млекопитающих. Однако некоторые вирусы содержат богатые адениловой кислотой олигонуклеотиды, функция которых неизвестна. По нуклеотидному составу ДНК вирусов животных более разнообразна, чем ДНК позвоночных: суммарное содержание гуанина и цитозина (ГЦ-содержание) у разных вирусов составляет от 35 ДО 74%, а у хордовых-— от 40 до 44%. Даже у вирусов, принадлежащих к одному роду (Herpesvirus), ГЦ-содержание варьирует от 46 до 74%.

Вирусы состоят из различных компонентов:

а) сердцевина - генетический материал (ДНК или РНК). Генетический аппарат вируса несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу и другие.

б) белковая оболочка, которую называют капсидом.

Оболочка часто построена из индентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии.

в) дополнительная липопротеидная оболочка.

Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина. Она встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес).

Просто организованные вирусы представляют собой нуклеопротеины, т.е. состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и несколько белков, образующих оболочку вокруг нуклеиновой кислоты. Белковая оболочка называется капсидом. Примером таких вирусов является вирус табачной мозаики. Его капсид содержит всего один белок с небольшой молярной массой. Сложно организованные вирусы имеют дополнительную оболочку, белковую или липопротеиновую. Иногда в наружных оболочка сложных вирусов помимо белков содержатся углеводы, например у возбудителей гриппа и герпеса. И их наружная оболочка является фрагментом ядерной или цитоплазматической мембраны клетки-хозяина, из которой вирус выходит во внеклеточную среду. Геном вирусов могут быть представлены, как однониточными, так и двунитчатыми ДНК и РНК. Двунитчатая ДНК встречается у вирусов оспы человека, оспы овец, свиней, аденовирусов человека, двунитчатая РНК служит генетической матрицей у некоторых вирусов насекомых и других животных. Широко распространены вирусы, содержащие однонитчатую РНК.

№8 Устойчивость вирусов животных к физико-химичкеским факторам

Разные группы вирусов обладают неодинаковой устойчивостью во внешней среде. Наименее устойчивы вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, наиболее устойчивы изометрические(капсид к-рых построен по кубоидальному типу симметрии. Имеют форму многогранников, чаще икосаэдра.) вирусы. Так ортомиксовирусы(семейство РНК-содержащих вирусов) и парамиксовирусы(семейство вирусов, вызывающих корь, эпидемический паротит (свинку), парагрипп, болезнь Ньюкасла, чумку у собак. Возможно, вызывают атипичную пневмонию). инактивируются на поверхностях за несколько часов, тогда как вирусы полиомиелита, адено-, реовирусы сохраняют инфекционную активность несколько дней. Однако из этого правила имеются и исключения. Так, вирус оспы устойчив к высыханию и сохраняется в экскретах многие недели и месяцы. Вирус гепатита В устойчив к действию неблагоприятных внешних факторов и сохраняет свою активность в сыворотке даже при кратковременном кипячении. Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению зависит преимущественно от размеров их генома. Чувствительность вирусов к формальдегиду и другим химическим веществам, инактивирующим генетический материал, зависит от многих условий, среди которых следует назвать плотность упаковки нуклеиновой кислоты в белковый футляр, размеры генома, наличие или отсутствие внешних оболочек. Вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, чувствительны к эфиру, хлороформу и детергентам, в то время как просто устроенные изометрические и палочковидные вирусы устойчивы к их действию. Важной особенность вирусов является чувствительность к РН. Есть вирусы, устойчивые к кислым значениям РН (2,2-3,0), например вирусы, вызывающие кишечные инфекции и проникающие в организм алиментарным путем. Однако большинство вирусов инактивируется при кислых и щелочных значениях РН.

№9 Репродукция вирусов

Репродукция вириона происходит только внутри восприимчивой клетки как в организме, так и вне организма. Механизм репродукции вирусов сложен и состоит из ряда последовательных этапов.

Адсорбция вирионов на клетке. Механизм адсорбции вириона на восприимчивой клетке основан на взаимодействии его рецепторов с комплементарными рецепторами клетки. Рецепторы клетки и вириона являются специфическими структурами, расположенными на их поверхности. Миксовирусы(группа вирусов, вызывающих заболевания у млекопитающих и птиц. Вирионы имеют сферическую форму и состоят из нуклеоида (рибонуклеопротеид со спиральным типом упаковки белков) и внешней оболочки, содержащей белки, липиды и углеводы. Различают ортомиксовирусы (рибонуклеиновая кислота имеет молекулярную массу около 3 млн. и состоит из нескольких фрагментов), к ним относят возбудителей гриппа человека, птичьей чумы; и парамиксовирусы (рибонуклеиновая кислота состоит из молекулы с молекулярной массой 6—7,5 млн.); к парамиксовирусам относят возбудителей ложной птичьей чумы и кори.) и аденовирусы(Состоят из белковой оболочки и ДНК, находящейся в центре вириона; не содержат липидов. Размер А. 70—90 ммк.) адсорбируются на мукопротеиновых рецепторах, а пикорнавирусы и арбовирусы ― на липопротеиновых рецепторах. Нейраминидаза у вириона миксовирусов разрушает мукогфотеиновые рецепторы и отщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту от олигосахарида, содержащего галактозамин и галактозу. Их взаимодействия на этом этапе обратимы, так как на них влияют температура, солевые компоненты и реакция среды. Адсорбции вириона на клетке препятствуют сульфатированные полисахариды и гепарин, несущие отрицательный заряд, но их ингибирующее действие снимается поликар-тионами (ДЭАЭ-декстран, экмолин, протамннсулъфат), которые нейтрализуют отрицательный заряд сульфатированных полисахаридов.

Проникновение вириона в клетку. Процесс проникновения вирионов в клетку у миксовирусов осуществляется ферментом нейраминидазой, который вступает в непосредственный контакт с мукопротеидами клетки. Научные факты, накопленные за последние годы, показывают, что РНК и ДНК вирионов не отделяются от внешней их оболочки, т. е. вирионы целиком проникают в чувствительную клетку путем виропексиса или пиноцитоза. Это доказано в отношении вирусов оспы, осповакцины и других вирусов живот-, ных. Что касается фагов, то они заражают клетки своей нуклеиновой кислотой. Механизм заражения основан на том, что вирионы, содержащиеся в вакуолях клетки, гидролйзуются ферментами (протеаз, липаз). При этом освобождается ДНК от внешней оболочки фага и проникает в клетку.

В эксперименте заражают клетки нуклеиновой кислотой, выделенной от некоторых вирусов, и вызывают один цикл репродукции "вирионов. Но в естественных условиях передача инфекции с помощью инфекционной кислоты не происходит.

Синтез вирусных структурных компонентов. Процессы синтеза компонентов РНК-вирусов происходят после проникновения нуклеопротеидов (вирионов) в клетку, где образуются вирусные полисомы путем комплексирования вирусной РНК с рибосомами. Затем синтезируются ранние белки: ре-прессоры клеточного метаболизма и РНК-полимеразы, транслируемые с родительской молекулой вирусной РНК. В цитоплазме мелких вирусов или в ядре (вирусы гриппа) образуется двунитчатая вирусная РНК путем комплексирования родительской «плюс»-це-почки с вновь синтезированной и комплементарной ей «минус»-це-почкой. Соединение этих нитей нуклеиновой кислоты обусловливает образование однонитчатой структуры РНК, называемой репликативной формой (РФ), которая устойчива к РНК-азе и необходима для репродукции всех РНК-вирусов. Синтез вирусной РНК осуществляется реплекативным комплексом, в котором участвуют фермент РНК-полимеразы, полисомы, репликативная форма РНК. Существуют два типа РНК-полимераз: РНК-полимераза I катализирует образование репликативной формы на матрице «плюс»-це-почки; РНК-полимераза II участвует в синтезе вирусной однонитчатой РНК на матрице репликативной формы. Синтез нуклеиновой кислоты у мелких вирусов осуществляется в цитоплазме. У вируса гриппа в ядре синтезируются РНК и внутренний белок. РНК выходит из.ядра и поступает в цитоплазму, где с рибосомами синтезирует вирусный белок, и образующийся рибонуклеопротеид входит в химический состав вириона.

Синтез компонентов ДНК-вирусов. После проникновения вирионов в клетку в ней подавляется синтез нуклеиновых кислот и клеточных белков. В ядре на матрице ДНК-вируса синтезируется и-РНК, несущая информацию для синтеза белков. Механизм синтеза вирусных белков осуществляется на клеточных рибосомах, и источником их построения является аминокислотный фонд клетки. Активизация аминокислот происходит ферментами, с помощью и-РНК переносятся в рибосомы (полисомы), где они располагаются в синтезированной молекуле белка.

Таким образом, в зараженной клетке синтез нуклеиновой кислоты и белков вириона происходит в составе сложного репликатив-но-транскриптивного комплекса, который, по-видимому, регулируется определенной системой контрольного механизма.

Формирование вириона осуществляется с участием структурных компонентов клетки. Вирусы полиомиелита, герпеса и осповакцины формируются в цитоплазме, а аденовирусов ― в 'ядре. Синтез вирусной РНК и образование нуклеокапсида (S-анти-гена) происходит в ядре, а гемагглютцнина (V-антигена) ―в цитоплазме. Затем S-антиген переходит из ядра в цитоплазму, где осуществляется формирование оболочки вириона. S-антиген покрывается вирусными белками, и в состав вириона включаются-гемагглютинины и нейраминидаза. И так происходит формирование потомства вируса гриппа.

Выход вирусов из клетки. Вирионы освобождаются из клеток двумя способами. Первый способ ― после полного созревания вирионов внутри клетки последние округляются, в них образуются вакуоли, разрушается клеточная оболочка; вирионы выходят одновременно и полностью из клетки (рикорнавирусы). Этот способ называется литическим. Второй способ ― вирионы освобождаются по мере созревания их на цитоплазматической мембране в течение 2―6 часов (арбовирусы,и миксовирусы). Освобождению миксовирусов из клетки, по-видимому, способствует нейраминидаза, которая разрушает клеточную оболочку. При этом способе 75― 90% вирионов спонтанно выходят в культуральную среду и клетки погибают постепенно (М. И. Соколов, 1972).

№10 Правила взятия, консервирования, пересылки, хранения и уничтожения патматериала

Патматериал берут из разных мест подлежащих исследованию органов и тканей от свежих трупов или только что убитых животных в чистую, сухую стеклянную или реже глиняную посуду.

Площадь кусочков органов и тканей, отбираемых для гистоисследования, не должна превышать 1-2 см2, толщина — 1 см. Из каждого органа берут 3-4 кусочка, мелкие органы берут полностью. При наличии видимых невооружённым глазом изменений в органах или тканях кусочки вырезают на границе так, чтобы в них попали измененные и неизмененные участки. Обязательно’ надо взять кусочки органа с капсулой. Головной мозг можно брать полностью (целиком) или вырезать кусочки с учетом особенностей заболевания центральной нервной системы. Почки, надпочечники, яичники надо брать так, чтобы попали корковый и мозговой слои.

Отобранный патматериал сразу же помешают в фиксирующую жидкость, количество которой должно быть в 10-15 раз больше, чем патматериала. На дно банки предварительно помещают слой ваты для равномерного пропитывания патматериала. Если патматериал в день взятия не отправлен в лабораторию, то через 24 часа фиксирующую жидкость сменяют. Смену фиксирующей жидкости осуществляют необходимое число раз до завершения процесса фиксации, о чём судят следующим образом. Один из кусочков разрезают поперёк, если при этом вся поверхность разреза окажется равномерного серо-белого цвета, то фиксация завершена, если центр кусочка имеет розовый цвет, то смену жидкости продолжают с суточным интервалом необходимое число раз. Следует помнить, что при фиксации в формалиновом растворе патматериал хранят в темном месте или в темной посуде.

Для гистоисследования можно направить целые трупы, органы или. их части в нефиксированном виде. В таком случае должна быть обеспечена быстрая доставка их в лабораторию.

Фиксирующие жидкости 1. Раствор формалина 10%-ной концентрации. Это наиболее распространенная, недорогая и универсальная фиксирующая жидкость. Раствор готовят на водопроводной или колодезной воде. Для приготовления 1 литра раствора берут 100 мл 40%-ного — формалина и 900 мл воды.

Лучше, пользоваться нейтральным формалином. Способ его приготовления: к 1 л продажного формалина добавляют 100-200 г молотого мела или углекислой магнезии. Полученный раствор в течение первого дня несколько раз перемешивают. Затем дают отстояться, после чего формалин готов для приготовления нейтрального раствора.\2. Ацетон или спирт с эфиром поровну. Эти вещества применяют для фиксации материала при необходимости исследования на бешенство. Формалиновая фиксация для этой цели непригодна.

3.Спирт-ректификат 96°-ный является универсальной фиксирующей жидкостью, которую можно применять во всех случаях. С целью экономии спирта кусочки патматериала берут размером 5x5x5 мм.

Во избежание промерзания материала при перевозке в зимнее время его необходимо хорошо профиксировать на месте, затем переложить в жидкость для транспортировки: 30-50%-ный раствор глицерина, приготовленный на 10%-ном растворе формальна или 70°-ного спирта.

Профиксированныи на месте патматериал можно пересылать в емкости меньшего размера. Фиксирующую жидкость и патматериал в таком случае можно брать в соотношении 1:3-5, а не 1:10-15, как это требуется для фиксации свежего патматериала. Правила упаковки и пересылки патматериала для

Гистологического исследования

Патматериал для гистоисследования можно направлять по почте и нарочным. В свежем (нефиксированном) виде патматериал направлять только с нарочным. В том и другом случае патматериал надо обязательно тщательно упаковывать, лучше в стеклянную посуду или в полиэтиленовую пленку (но не в мешочек, который может разорваться по шву). Затем уложить в деревянный или металлический ящик, приняв при этом все меры предосторожности против разрыва пленки и рассеивания возбудителей болезней во внешней среде. Упаковка должна гарантировать доставку патматериала в целости. На верхней стороне ящика делает— надпись: «Осторожно — стекло», «Верх».

При отсутствии полиэтиленовой пленки материал можно упаковывать в клеенку, брезент, холст, мешковину, смоченные креолином, лизолом или другим дезинфицирующим раствором.

При пересылке фиксированного или консервированного патматериала емкость герметически закрывают пробкой (стеклянной, резиновой, пробковой или деревянной). Пробку закрепляют тонкой проволокой или шпагатом и заливают сургучом или смолой, воском, парафином, менделеевской замазкой. На банки с кусочками органов и тканей наклеивают этикетки с указанием номера иго: клички животного, внутрь банки кладут этикетку из ватмана или картона, полотна с написанным тушью или простым (не химическим) карандашом номером животного.

В банку лучше брать патматериал от одного животного. Если берут от нескольких животных в одну банку, то кусочки от каждого животного с этикеткой (номером) завязывают в кусочки марли. Банки устанавливают в ящик и плотно обкладывают их ваток или паклей, бумагой, опилками, стружками, соломой, чтобы они не разбились при транспортировке. Ящик закрывают и опечатывают.

Профиксированный на месте патматериал для пересылки можно пересылать в лабораторию без использования посуды. Для этого его следует обложить ватой, смоченной фиксирующей жидкостью, тщательно завернуть в клеенку, а затем упаковать в ящик.

Если надо пересылать целые органы или их куски толщиной более 3 см, то для лучшего проникновения фиксирующей жидкости следует сделать на органах разрезы и вложить туда вату.

Кости упаковывают в полиэтиленовую пленку или целлофан, клеенку, марлю, ткань, смоченные в каком-либо дезинфицирующем растворе.

При пересылке нефиксированного патматериала от животных, болевших особо опасными болезнями (сибирская язва, бешенство, шумящий карбункул, бруцеллез, чума, инфекционная анемия, туляремия, ящур) должна соблюдаться особая осторожность. Такой патматериал помещают э герметически закрываемую емкость. Крышку укрепляют, заливают сургучом или другим веществом. Емкость устанавливают в металлический ящик (коробку), который необходимо запаять, опломбировать или опечатать, а затем металлический ящик поместить в деревянный и сделать надпись: «Осторожно — стекло», «Верх». Если такой материал отправляют с нарочным, то герметически закрытые банки можно тщательно упаковывать в деревянный ящик без металлической коробки.

К посылаемому патматериалу прилагают сопроводительный документ на упаковку материала и протокол вскрытия трупа или осмотра убитого животного.В сопроводительной на упаковку указывают, какой патматериал направлен, сколько, в какой посуде, какая фиксирующая жидкость использована, род упаковки. Один экземпляр сопроводительной отправляют запечатанным в конверт вместе с патматериалом, а второй остается у отправителя. В случае обнаружения в лаборатории или на кафедра несоответствия упаковки, количества патматериала с данными сопроводительного документа или обнаружения порчи патматериала составляется акт. Копия такого акта отсылается отправителю патматериала.

№ 11 Основные этапы, методы выделения и идентификации вирусов

 В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

    Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

    В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

    В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

    Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

    Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект),

образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

    Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

№ 12 Способы титрования вирусов

Количество вирусов определяетсяпо титру. Титр вируса – количество вируса, аодержащегося в единице объема патологического материала.

В практике существут 3 типа ЕД количества вируса:

1. Инфекционная ед локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту

2. 2) инфекционная ед 50% действия вирусов на чувствительные живые системы, оцениваются они статистически

3. Гемаглютинирующие ед

Локальные повреждения – бляшкиБОЕ и ООЕ (блякообразующие и оспаобразующие единицы)

1 БОЕ = доза вируса, которая вызывает образование одной бляшки

Для определения титра вирусов в БОЕ и ООЕ заражают куриные эмбрионы и считают средние ед бляшек и оспы.

Т= n/V*a, где T – титр

N – среднее арифметическое кол-во бляшекНа один матрас(култ. Флакон) или оспы на эмбрион.

V – объем заражающий дозы

А – разведение вирус-содержащего материала взятого для заражения

2 метод: более универсальный.

За ед кол-ва вируса принимается такая доза вируса, которая способна вызывать эффект у 50 % зараженных тест-объектов

Этот метод требует статистической обработки, он длительный, трудоемкий. Берется десятикратное разведение.

Рассчет титра по Риду:

Lg ЛД50 = lgB – (b-50)/(b-a)* lgd

B- разведение дающее эффект более 50%

b- % того разведения, которое дает эффект боле 50%

1. % сооотв разведения, дающий эффект менее 50%

d- коэфициент разведения

недостаток: Более высокая доза вируса не всегда вызывает и более высокий эффект

Метод по Керберу:

Lg ЛД= lgД + lgd/2 – lg d * сумму r/n

Д – высшее разведение вируса, который дает 100% эффект

d-коэфициент разведения

r- количество положительно реагирующих тест-объектов на кол-во разведения

3 метод: Геммаглютинирующий

За 1 ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способна аглютинировать около 50% иритроцитов, содержащихся в том же что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эритроцитов

Готовят 1% взвесь эритоцитов

Готовят ряд последовательных двукратных разведений, исслед. Вирус-содержащего материала в равных объемах.

Разливают по лункам и добавляют по 0,5 1% звеси эритроцитов

Интенсивность геммаглютинации в пробирке оценивают в крестах

Методов титрования вирусов на сегодняшний день существует множество. Определяют способность вируса склеивать (агглютинировать) эритроциты (красные клетки крови), вызывать поражение клеточного пласта в пробирке, инфицировать организм мышей или других животных, заражать куриный эмбрион и т. д.

Наименьшее количество вируса, способное вызвать учитываемую реакцию, принимают за инфекционную единицу. Например, минимальное количество вируса, с которого начинается развитие инфекции в курином эмбрионе, называют ЭИ — эмбрион-инфицирующей дозой, а вызывающее поражение клеток в пробирке — ТЦПД — тканевая цитопатогенная доза, и т. п.

Инфекционная единица и вирусная частица — это, как установлено, далеко не одно и то же. В зависимости от типа вируса одна инфекционная единица может содержать от нескольких вирусных частиц до десятков тысяч вирионов.

Широко используют вирусологи метод титрования вирусов при помощи подсчета очагов поражения, или, как его называют, метод бляшек под агаром.

Чтобы провести титрование по бляшкам, необходимо вначале получить на стекле стерильных флаконов клеточные культуры. Полученные клеточные поля заражают последовательными разведениями изучаемого вируса, то есть вносят все меньшие и меньшие его дозы.

Б каждый флакон как бы направляется десант диверсантов. Опускаясь на клетки, вирусы тут же приступают к разрушительной работе, уничтожая гарнизоны клеток, обращая «в свою веру» клеточные молекулы и используя их для производства себе подобных. Вскоре вместо одного пришельца вырастают полчища диверсантов.

В зависимости от степени разведения в каждый флакон с культурой попадает различное число вирусных частиц. В одни флаконы их вносят миллионы, в другие — тысячи, в третьи — единицы.

В обычных условиях вирусы, размножаясь, быстро поразили бы все клетки, если бы не хитроумный способ избежать этого. Клетки после заражения вирусом покрывают питательным веществом — агаром, которое, остывая, приобретает плотную консистенцию.

Теперь вирусы не могут беспрепятственно разгуливать по всей клеточной культуре, а вынуждены пробиваться от одного гарнизона к соседнему — от клетки к клетке. В том месте, куда попал вирус, образуется очаг поражения

В образцах аллантоисной жидкости перед их объединением и инактивацией титруют содержание вируса, используя реакцию гемагглютинации.

Согласно стандартизованной методике, эту реакцию ставят либо в круглодонных пробирках диаметром 12 мм, либо (лучше) на панелях для гемагглютинации, рекомендуемых ВОЗ (8 рядов по 10 лунок со сферическим дном). В первую пробирку вносят 0,5 мл, а в остальные 9 пробирок — по 0,25 мл физиологического раствора. В первую пробирку добавляют 0,05 мл аллантоис­ной жидкости (т.е. начальное разведение 1:11, или 1,04 в лога­рифмических единицах); затем, перенося по 0,25 мл из лунки в лунку, делают серию двукратных разведений в интервале от 1 : 11 до 1: 5632 (от 1,04 до 3,75 логарифмических единиц). После этого в каждую лунку вносят по 0,025 мл 5%-ной взвеси кури­ных эритроцитов в физиологическом растворе. Панели встряхи­вают и помещают в холодильник при 4°С. Спустя 20 мин их встряхивают повторно. Реакцию учитывают после 40 мин инку­бации при 4°С.

При отсутствии агглютинации (—) осевшие эритроциты об­разуют на дне лунки плотную пуговку, тогда как при полной агглютинации (+ + ) они тонким розовым слоем покрывают все дно. За конечную точку титрования условно принимают такую степень агглютинации ( + ), при которой диаметр осадка эритро­цитов составляет одну треть диаметра лунки. Интерполируя к этой конечной точке, реакцию можно учесть с точностью +0,033 логарифмической единицы (±8%); если же за конечную точку титрования принять последнюю пробирку с поЛной агглю­тинацией, то ошибка метода возрастет до ±0,27 логарифмичес­кой единицы (±86%).

Если титрование проводят на панелях микротитратора (в объеме 0,025 мл; первое разведение 1:2), концентрацию взвеси эритроцитов уменьшают до и смесь инкубируют дважды по 20 мин при 4°С. Ошибка метода при этом не менее ±0,2 логариф­мической единицы (±58%).