2

Заняття №1

Тема: Структура, класифікація та особливості життєдіяльності вірусів. Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій та їх особливості. Особливості противірусного імунітету

Теоретичні питання:

1. Загальна характеристика вірусів.

2. Класифікація вірусів.

3. Морфологія та ультраструктура вірусів.

4. Організація геномів і загальні принципи реплікації вірусів.

5. Методи культивування вірусів.

6. Методи виділення, індикації та ідентифікації вірусів:

а) накопичення вірусів в культурі клітин, курячих ембріонах та чутливих тваринах. Виділення і очистка вірусів (диференціальне та градієнтне ультрацентрифугування, ультрафільтрація, висолювання, іонообмінна та молекулярно-ситова хромотографія );

б) методи індикації вірусів: цитопатична дія вірусів

(ЦПД, поява внутрішньоклітинних включень, утворення синцитія, поява хромосомних аномалій), зараження чутливих тварин, електронна мікроскопія, реакція гемаглютинації;

в) методи ідентифікації вірусів: імунологічні методи (реакція нейтралізації in vivo та in vitro, реакція гальмування гемаглютинації (РГГА), імунофлюоресцентна мікроскопія (ІФ), реакція імунодифузії (РІД) за Оухтерлоні, імуноферментний аналіз (ІФА). Молекулярні методи детекції та аналізу нуклеїнових кислот вірусів ( молекулярна гібридизація, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).

4. Серологічні методи діагностики вірусних інфекцій: реакція зв’язування комплемента (РЗК), реакція непрямої гемаглютинації та реакція гальмування гемаглютинації (РНГА/РГГА), РІД, радіоімунологічний аналіз (РІА), ІФА.

5. Особливості противірусного імунітету. Специфічна профілактика вірусних інфекцій.

Методичні рекомендації по виконанню практичної роботи

1 . Перещеплювальна культура клітин Vero

Для культивування вірусів, в лабораторній практиці використовують різноманітні культури кліин. В демонстраційному препараті студент повинен побачити Походження клітин – нирка зеленої мавпи. До цієї культури клітин чутливі віруси Коксакі В (1-6), поліовіруси (1-3), арбовіруси, реовіруси, вірус везикулярного стоматиту, вісповакцини, простого герпесу.

2. Цитопатична дія поліовірусу (іі) на культурі клітин Vero

Д осліджуваний матеріал, в якому припустимо знаходиться цікавлячий нас вірус, суспендують в невеликому об’ємі культурального середовища, фільтрують через міліпоровий фільтр для видалення бактерій і вносять в культуральний флакон, який містить моно-шарову культуру сприйнятливих клітин. Через 48 – 72 години реєструють появу змін. Простим оком видно повну чи часткову деградацію моношару і його злущування з поверхні флакона. Морфологічні зміни клітин виявляють за допомогою інвертованого мікроскопа.

Під час розмноження вірусу поліомієліту (ІІ типу), в даній культурі клітин, відзначають характерну цитопатичну дію за типом повної дегенерації моношару клітин: клітини, що містять вірус, кругліші, зморшкуваті, у ядрах відбуваються пікнотичні зміни.

2. Середовище 199, Ігла та інші

Середовище 199 – синтетичне середовище, яке включає біля 60 компонентів. Застосовується для культивування перещеплювальних та первинно-трипсонізованих культур клітин.

Середовище Ігла – містить мінімальний набір амінокислот (13) і вітамінів (8). Застосовується для культивування диплоїдних та перещеплювальних культур клітин.

Курячі ембріони. Овоскоп.

Для виділення деяких вірусів застосовуються курячі ембріони від 5 до 12-14 діб. При цьому вік використовуваних ембріонів, засіб зараження та строки одержання максимальної кількості вірусів (час інкубації) залежить від біологічних властивостей культивованих вірусів та їх тропізму. Перед зараженням курячі ембріони овоскопують для визначення їхньої життєздатності. Ознаки живого ембріона – наявність самостійних рухів, добре виражений судинний малюнок, пульсація судин.

Існує кілька способів зараження курячих ембріонів:

• у порожнину амніона й алантоїсу;

• на хоріоналантоїсну оболонку;

• в жовчний мішок.

2. Рнга з парними сироватками для діагностики герпетичної інфекції

РНГА оцінюється за наявністю чи відсутностю аглютинації еритроцитів. Приріст антитіл відмічають при одночасному титруванні парних сироваток, які були взяті в перші дні захворювання (або імунізації) та на 15-20 добу від початку захворювання (або закінчення імунізації). Діагностичне значення має виявлення 4-кратного та більше збільшення титру антитіл в другій сироватці.

Врахуйте результат, оформте протокол, зробіть висновки.

Протокол дослідження

Досліджувана особа	День обстеження	Розведення сироватки хворого
		1/20	1/40	1/80	1/160	1/320	1/640	К
Хворий А.	2-й
	15-й