- •020209.65 «Микробиология»
- •Глава 1. Характеристика микроорганизмов - объектов биотехнологических производств
- •1.1. Строение прокариотической (бактериальной) клетки
- •1.2. Размножение бактерий
- •1.3. Строение эукариотической клетки
- •1.4. Характеристика наиболее важных представителей различных классов грибов, их размножение
- •1.5. Дрожжи. Их формы, размеры. Размножение дрожжей. Принципы классификации дрожжей
- •Глава 2. Метаболизм. Принципы регуляции обмена веществ микрорганизмов
- •Глава 3. Генетика микроорганизмов. Пути совершенствования микробиологических производств методами генной инженерии
- •3.1. Генотип и фенотип микроорганизмов
- •3.2. Формы изменчивости микроорганизмов
- •3.3. Типы мутантных штаммов продуцентов
- •3.4. Способы получения мутантных штаммов микроорганизмов
- •3.4.1. Селекционные методы получения мутантов
- •3.4.2. Генетическая модификация микроорганизмов
- •3.4.3. Методы генной инженерии
- •3.4.4. Конструирование рекомбинантной днк
- •3.4.4.1. Встраивание днк в вектор
- •3.4.4.2. Генетическая трансформация клеток бактерий
- •3.4.4.3. Экспрессия чужеродных генов в клетках бактерий
- •Глава 4. Культивирование микроорганизмов
- •4.1. Рост и развитие микроорганизмов
- •4.2. Оптимальные условия культивирования
- •4.3. Промышленные способы культивирования микроорганизмов
- •Глава 5. Общие принципы биотехнологических производств
- •5.1. Основная схема технологического процесса
- •Х ранение
- •5.2. Этапы технологического процесса
- •5.2.1. Приготовление питательной среды
- •5.2.2. Подготовка посевного материала
- •5.2.3. Ферментация (культивирование)
- •5.2.4. Выделение целевого продукта
- •5.2.5. Очистка целевого продукта
- •Глава 6. Производство микробной биомассы
- •6.1. Получение и использование биомассы одноклеточных
- •6.1.1. Получение дрожжевого белка
- •6.1.2. Получение бактериальной биомассы
- •6.1.3. Получение грибного белка (микопротеина)
- •Получение водорослевого белка
- •6.2. Получение энзиматически активной биомассы
- •6.2.1. Получение хлебопекарских дрожжей
- •6.2.2. Получение заквасок молочной промышленности
- •6.2.3. Получение бактериальных удобрений
- •6.3. Получение и использование микробных инсектицидов
- •6.3.1. Получение бактериальных энтомопатогенных препаратов
- •6.3.2. Получение грибных энтомопатогенных препаратов
- •6.3.3. Получение вирусных энтомопатогенных препаратов
- •6.4. Получение и использование вакцин
- •Глава 7. Производство ферментных препаратов
- •7.1. Технология получения ферментов микроорганизмов
- •7.2. Иммобилизованные ферменты
- •7.3. Иммобилизация клеток
- •7.4. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток
- •Глава 8. Получение продуктов микробиального синтеза
- •8.1. Биотехнология получения первичных метаболитов
- •8.1.1. Производство аминокислот
- •8.1.2. Производство витаминов
- •8.1.3. Производство органических кислот
- •8.2. Биотехнология получения вторичных метаболитов
- •8.2.1. Получение антибиотиков
- •8.3. Биотехнология получения метаболитов, с использованием генномодифицированных микроорганизмов
- •Глава 9. Использование микроорганизмов в пищевой промышленности
- •9.1. Производства, основанные на спиртовом брожении
- •9.1.1. Хлебопекарное производство
- •9.1.2. Производство пищевого спирта
- •9.1.3. Производство пива
- •9.1.4. Производство вина
- •9.2. Производства, основанные на молочнокислом брожении
- •9.2.1. Производство кисломолочных продуктов
- •9.2.2. Производство сыров
- •Глава 10. Использование микроорганизмов в охране окружающей среды
- •10.1. Биологическая обработка органических отходов
- •10.1.1. Биологическая очистка сточных вод
- •10.1.2. Биологическая обработка твердых отходов
- •10.2. Биоремедиация загрязненных почв и грунтов
- •Глава 11. Использование микроорганизмов в технологии металлов
6.3. Получение и использование микробных инсектицидов
Инсектициды (от лат. insectum – насекомое и лат. caedo – убиваю) – препараты для уничтожения вредных насекомых. Инсектициды химической природы обладают мутагенным и канцерогенным действием, кроме того, они с трудом разрушаются и накапливаются в окружающей среде.
В отличии от химических микробиологические инсектициды (энтомопатогенные препараты) высоко специфичны и действуют только на определенные вредные насекомые. Патогенность микроорганизмов вызвана действием определенных токсинов, поэтому выработки устойчивости к биопрепаратам у насекомых не происходит. Микробные пестициды подвержены биодеградации.
Для получения микробиологических инсектицидов используются вирусы, грибы, спорообразующие бактерии.
Энтомопатогенные препараты классифицируются:
1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis – энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.
3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и др.).
Все микробные патогены выпускаются в виде смачивающих порошков, паст, реже – гранул, эмульсии спор и кристаллов.
6.3.1. Получение бактериальных энтомопатогенных препаратов
Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.
Характеристика препарата. Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует ряд токсичных продуктов. Среди этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:
α-экзотоксин, или фосфолипаза С, – продукт растущих клеток бактерий. Токсическое действие фермента связывают с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в ткани насекомого, что приводит к гибели последнего.
β-экзотоксин – накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β-экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.
γ-экзотоксин – малоизученный компонент, неидентифицированный фермент (или группа ферментов).
δ-эндотоксин – параспоральный кристаллический эндотоксин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противоположной от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника.
Бактерии Bac. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. В зависимости от реакции на кристаллы насекомые делятся на три группы:
характерен общий паралич;
паралич среднего отдела кишечника;
реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий.
Технология производства энтомопатогенных бактерий. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.
Промышленное производство энтомопатогенных бактерий (ЭБ) заключается в глубинном культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам ЭБ: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д.
Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства.
Составление питательной среды. Для культивирования Bac. thuringiensis используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи – 2 – 3; кукурузную муку – 1 – 1,5; кашалотовый жир – 1.
Подготовка посевного материала.
Внесениение посевного материала.
Размножение культуры. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28 – 30 оС), продолжительность ферментации составляет 35 – 40 часов. Перед началом культивирования рН составляет около 6,3, к концу ферментации – повышается до 8,0 – 8,5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6,0 – 6,2. Культивирование заканчивают титре спор не менее 109 в 1 мл.
После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.
Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2 – 10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1 – 3 кг, садовых – 3 – 5 кг.