С.І. Климнюк І.О. Ситник М.С. Творко В.П. Широбоков

П Р А К Т И Ч Н А М І К Р О Б І О Л О Г І Я

Рекомендовано Центральним методичним кабінетом з вищої медичної освіти МОЗ України як навчальний посібник для студентів вищих медичних навчальних закладів IVрівня акредитації (протокол № 2 від 30.03. 2004р.)

Тернопіль "Укрмедкнига" 200

4ББК 28.4я73 П 69

УДК 616-093/-098(075.8)

Рецензенти: зав. кафедри імунології, алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії, доктор мед. наук, проф. І.Й. Сидорчук. зав. кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії, доктор мед. наук, проф. Г.М. Кременчуцький.

Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П.

П 69 Практична мікробіологія: Посібник. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - 440 с.

ISBN 966-673-059-6

Матеріал посібника подано відповідно до навчальної програми з курсу мікробіології, іму­нології та вірусології. Він складається з шести частин. Частина перша - "Загальна мікробіоло­гія" - містить дані про організацію і режим роботи бактеріологічних лабораторій, методи дослідження морфології, фізіології, екології та генетики мікроорганізмів, визначення чутли­вості їх до антибіотиків. Друга частина присвячена імунологічній діагностиці інфекційних хвороб, методам їх специфічної профілактики та лікування. В третій частині описані основні властивості збудників бактеріальних інфекцій і методи їх лабораторної діагностики. Четверта частина присвячена характеристиці і класифікації вірусів та методів класичної і експрес-діаг- ностики вірусних інфекцій. У п'ятій частині представлені основні відомості про найбільш поширені гриби, їх морфологічні особливо сті та лабораторні методи діагностики мікозів. Шоста частина містить дані про мікроскопічні дані найбільш поширених збудників протозоозів і методи діагностики захворювань, викликаних найпростішими.

Посібник призначений для студентів медичних факультетів вищих навчальних закладів IV рівнів акредитації.

ББК 28.4я73

ISBN 966-673-059-6

УДК 616-093/-098(075.8)

© Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П., 2004.

Передмова

УХХІ столітті постали важливі і невідкладні проблеми в галузі інфекційної патології. Економічна нестабільність життя населення, масова міграція людей призвели до значного погіршення епідеміологічної ситуації відносно особливо небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, лептоспіроз, та ін.). Значно зросла захворюваність на туберкульоз, дифтерію, гонорею, сифіліс, харчові токсикоінфекції.

Швидке постаріння людей, несприятлива екологічна ситуація, збільшення кількості осіб із супровідними бактерійними, грибковими і протозойними захво­рюваннями зумовило зростання патологічних процесів, викликаних умовно- патогенними мікроорганізмами. Широке розповсюдження мають госпітальні, хронічні, змішані та ендогенні інфекції. З року в рік зростає кількість таких нозологічних форм, як сепсис, септикопіємії, неспецифічні інфекції, і гнійно- септичні захворювання шлунково-кишкового тракту, інфікування післяопера­ційних, опікових і посттравматичних ран, мікробіологічна діагностика яких розроблена ще недостатньо.

Бурхливий розвиток вірусології, збільшення частоти таких вірусних інфекцій як грип, гепатити, СНІД, геморагічні гарячки, енцефаліти, герпес, краснуха та ін. вимагають ретельного вивчення студентами особливостей їх лабораторної діагностики.

У програмах і навчальних планах чільне місце відводиться вивченню важливих проблем імунології, освоєнню методів імунологічної діагностики інфекційних хвороб, визначенню тестів імунологічного статусу людини, знайомству з методами виготовлення вакцин, діагностикумів, імунних сироваток тощо. Окрім того, у ВНЗ введено курс клінічної імунології, а в окремих з них створені навіть кафедри імунології. Це вимагає детального викладу постановки необхідних реакцій і тестів, методика і оцінка яких зазнали чималих змін.

У даному посібнику описані способи і методики мікроскопічної, бакте­ріологічної (вірусологічної), серологічної, імунологічної, біологічної та алерго­логічної діагностики інфекційних хвороб. Велика увага приділена використанню експрес-діагностики, новітнім люмінесцентно-серологічним дослідженням, реакціям коаглютинації і латекс-аглютинації, застосуванню таких високо­чутливих методів як імуноферментний, імуноелектронний, радіоімунний, визна­чення імунних комплексів, моноклональних антитіл, реакцій гальмування гема­глютинації, непрямої гемаглютинації та ін.

Назви мікроорганізмів, схеми їх класифікацій подано відповідно до між­народної системи та номенклатури, викладених у "Bergey's manual of systematic bacteriology" (1994).

Усі критичні зауваження і побажання щодо покращання посібника автори приймуть із щирою вдячністю.Список умовних скорочень

АО - антитоксична одиниця

БУО - бляшкоутворююча одиниця

ВІЛ - вірус імунодефіциту людини

ГНТ - гіперчутливість негайного типу

ГСТ - гіперчутливість сповільненого типу

ДНК - дезоксірибонуклеїнова кислота

ІФА - імуноферментний аналіз

КОА - коаглютинація

КУО - колонієутворююча одиниця

ЛАГ - латекс-аглютинація

МО - міжнарожна одиниця

МПА - м'ясо-пептонний агар

МПБ - м'ясо-пептонний бульйон

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

РА - реакція аглютинації

РГА - реакція гемаглютинації

РГадс - реакція гемадсорбції

РГГА - реакція гальмування гемаглютинації

РГГадс - реакція гальмування гемадсорбації

РГНГА - реакція гальмування непрямої гемаглютинації

РЗК - реакція зв 'язування комплементу

РЗНГА - реакція зворотної непрямої гемаглютинації

РІА - радіоімунний аналіз

РІФ - реакція імунофлуоресценції

РНГА - реакція непрямої гемаглютинації

РН - реакція нейтралізації

РНК - рибонуклеїнова кислота

РП - реакція преципітації

РПГ - реакція преципітації в гелі

СНІД - синдром набутого імунодефіцит

УЧастина і загальна мікробіологія

Розділ 1

Організація, устаткування, режим роботи бактеріологічних, імунологічних і вірусологічних лабораторій

Бактеріологічні лабораторії - спеціальні науково-дослідні, науково-прак­тичні або практичні установи, в яких проводять мікробіологічні, біологічні та серо­логічні дослідження. Їх організовують при профільних науково-дослідних інститу­тах, навчальних закладах, клінічних лікарнях, санітарно-епідеміологічних станціях (СЕС). Мікробіологічні лабораторії в лікувально-профілактичних установах вико­нують відповідні аналізи з метою діагностики інфекційних хвороб, визначення строків виписування хворих з лікувальних закладів, визначення чутливості збуд­ників до антибіотиків та інших препаратів, здійснюють контроль за ефективністю хіміотерапії, дотриманням санітарно-протиепідемічного режиму.

Бактеріологічні лабораторії районних СЕС проводять санітарно-бактеріоло­гічні аналізи води і харчових продуктів, мікробіологічні дослідження випорожнень, сечі, жовчі, блювотних мас, промивних вод шлунка з метою виявлення хворобо­творних і умовно-патогенних бактерій, виділення гемокультур при черевному тифі, паратифах, сепсисі та інших захворюваннях. Досить часто тут роблять аналізи харкотиння, слизу з рото- і носоглотки для виділення збудників туберкульозу, диф­терії, коклюшу, назофарингіту, проводять серологічну діагностику тифів, туля­ремії, бруцельозу, дослідження крові на виявлення малярійних плазмодіїв

.Бактеріологічні лабораторії міських і обласних СЕС, окрім вищеперелічених досліджень у більш повному обсязі, проводять аналізи повітря, посіви перев'язу­вальних матеріалів та лікарських препаратів на стерильність, змивів з рук, інстру­ментів та інвентаря лікарняних і дитячих закладів, підприємств громадського хар­чування, за епідеміологічними і санітарними показаннями, а також для перевірки якості поточної і заключної дезінфекції. У лабораторіях такого рангу проводять повний аналіз на кокову, анаеробну і кишечну мікрофлору, постановку реакцій нейтралізації правцевого, ботулінового і стафілококового токсинів, визначення чутливості виділених збудників до антибіотиків методом серійних розведень, серо­логічні та люмінесцентно-серологічні дослідження при інфекційних захворюван­нях, фаготипування і бактеріоцинотипування сальмонел і стафілококів, визначення видів атипових мікробних культур. З метою попередження або виявлення госпіталь­них інфекцій проводять дослідження носійства стафілококів, сальмонел та інших мікроорганізмів серед медичного персоналу, а також серед працівників харчоб­локів і служб водопостачання для профілактики харчових токсикоінфекцій, здійснюють діагностику дисбактеріозів.

Планування, організація, устаткування і режим роботи бактеріологічної ла­бораторії повинні забезпечити основні вимоги до таких специфічних установ, тобто створити умови, які б забезпечили проведення досліджень при дотриманні сте­рильності, гарантували безумовне виключення можливого зараження персоналу і відвідувачів та спонтанну контамінацію мікробами довкілля, живильних середо­вищ, виділених чистих культур та інших матеріалів.

У структуру звичайної мікробіологічної лабораторії входить ряд приміщень спеціального призначення: одна або декілька лабораторних кімнат, бокс із перед- боксником, приміщення для приготування живильних середовищ (кухня), авто- клавна (стерилізаційна), термостатна, мийка, препараторська, кімната для забору або прийому досліджуваного матеріалу і його реєстрації, віварій для лаборатор­них тварин. Усі приміщення розташовують так, щоб заразний ("брудний") матеріал не стикався і не перехрещувався з "чистим".

Функціональні кабінети мають бути світлими, просторими, теплими, з підве­денням гарячої і холодної води, електричного струму, з виходом вікон на північ або північний захід. Стіни, двері, підлогу виготовляють із матеріалів, які легко миються і дезінфікуються.

Лабораторна кімната - основне приміщення для проведення досліджень. Жор­сткий протиепідемічний режим роботи вимагає її щоденного вологого прибиран­ня та щомісячного проведення дизінфекції підлоги, стін, столів і обладнання. Ро­бочі столи покриваються спеціальним пластиком або склом. У лабораторії доц­ільно виділити й обладнати окремі робочі місця та закріпити їх за кожним співробітником.

На робочому столі лікаря-мікробіолога повинні знаходитись тільки предмети, необхідні для проведення бактеріологічних досліджень: газовий пальник (спир­тівка), пастерівські й градуйовані піпетки, пінцети, бактеріологічні петлі, шпателі, предметні та покрівні скельця, пробірки, штативи, чашки Петрі, аглютиноскоп, лупа, мікроскоп, банка з дезінфікуючим розчином. Біля стола повинна стояти по­судина з дезрозчином, куди опускають відпрацьований заразний матеріал, який потім автоклавується.

Меблі бактеріологічної лабораторії мають бути простими, зручними, які легко миються і дезінфікуються. Сучасна лабораторія оснащується мікроскопами, авто­клавами, термостатами, сушильними шафами, центрифугами, дистилятором, апа­ратом для згортання сироватки, рН-метром, холодильником, лабораторною вагою, фотоелектроколориметром, апаратом для автоматичного підрахунку колоній, бак­терійними фільтрами, комп 'ютером, бактерицидними лампами.

Для проведення мікробіологічних досліджень в особливо стерильних умо­вах відводять окрему кімнату або бокс. Його площа повинна розраховуватись для роботи двох чоловік (5-8 м²), мати окремий вхід через тамбур (передбоксник).

Меблі, які встановлюють у боксі (стіл, стільці, невелика шафа для стерильного посуду, середовищ тощо), мають бути простими, краще металевими, що спрощує їх знезараження. Стіни покривають облицювальною плиткою або світлою масля­ною фарбою, підлогу вистилають гладенькими плитами або лінолеумом. У там­бурі має бути водопровідний кран і умивальник для миття рук.

Сучасні бокси мають систему подачі стерильного повітря або ламінарних його потоків, що створює найкращі умови стерильності й безпеки. Перед початком і після роботи проводять вологе прибирання, дезінфекцію та опромінення бактери­цидними лампами протягом 1-2 год. Повітря боксів систематично перевіряють на обсіменіння мікробами.

Для малих об'ємів роботи існують переносні настільні бокси або бокси-сто- ли. Робочу його частину складає невелика скляна камера (100x70x70 см), яка має два отвори для рук, оснащені спеціальними нарукавниками. Кращим варіантом таких боксів є бокс з ламінарним потоком стерильного повітря.

Окрім звичайних бактеріологічних лабораторій в усіх обласних центрах, а також у великих морських портах організовують лабораторії для проведення діаг­ностики особливо небезпечних інфекцій (чума, холера, сибірка, туляремія, бруце­льоз, сап, меліоїдоз, лептоспіроз, геморагічні гарячки та ін.). У цих лабораторіях встановлюють більш жорсткий протиепідемічний режим, який регламентується спеціальними інструкціями. Тут працює спеціально підготовлений персонал; осо­би, які мають протипоказання для проведення щеплень, до роботи в таких лабо­раторіях не допускаються.

Вірусологічні лабораторії - установи, які вивчають віруси, проводять діаг­ностику вірусних інфекцій, виготовляють різноманітні вірусні препарати (вакци­ни, діагностикуми, противірусні імунні сироватки тощо). Устрій та їх оснащення дещо відрізняються від бактеріологічних лабораторій. У структурі вірусологічної лабораторії обов'язково повинен бути бокс з тамбуром і ряд підсобних приміщень для обробки і стерилізації посуду, виготовлення живильних середовищ для виро­щування клітинних культур, інкубатора для розвитку курячих ембріонів, устатку­ванням для ліофілізації вірусів, віварій та ін.

Окрім звичайного лабораторного оснащення, необхідно мати гомогенізатори для подрібнення тканин, камери для глибокого і надмірного заморожування до температур -30-70 °С, холодильники, які можуть тримати температуру -20 °С, цен­трифуги на 2-3, 12-15 і 60 тис. об/хв. Для збереження клітинних культур потрібні судини Д'юара з рідким азотом.

Перед і після роботи проводять вологе прибирання та дезінфекцію приміщень таким же способом, як і бокси в бактеріологічних лабораторіях.

У мікологічних лабораторіях проводять мікроскопічні дослідження та ідентифікацію культур патогенних грибів з метою діагностики мікозів, рідше - ставлять досліди на тваринах. Режим їх роботи повинен попередити розсіювання зараженого грибами матеріалу, щоб уникнути інфікування персоналу. Робочі місця тримають у зразковому порядку, особистий одяг і речі зберігають у спеціально відведеному місці.

Лабораторні столи покривають листовим склом, одну половину якого знизу фарбують у чорний колір, другу - в білий. На чорному фоні краще помітні світлі культури грибів, на білому - відтінки пігменту досліджуваних колоній. Необхідно мати лампу з фільтром Вуда для відбору ураженого волосся при освітленні ультра­фіолетовими променями.

При роботі з пліснявими грибами, які утворюють величезну кількість летючих спор, для захисту дихальних шляхів необхідно користуватись марлевими пов'яз­ками (масками). Досліджуваний матеріал беруть лише за допомогою інструментів: ложечок Фолькмана, лопаточок, манікюрних кусачок, епіляційних, анатомічних та хірургічних пінцетів, платинових петель, препарувальних голок тощо. Знезара­ження відпрацьованих матеріалів проводиться такими ж способами, як і в бакте­ріологічних лабораторіях.

Діагностичні мікологічні лабораторії організовують при шкірно-венерологіч­них диспансерах. Із збудниками особливо небезпечних мікозів (бластомікоз, гісто- плазмоз, кокцидіомікоз) працюють лише в спеціально оснащених лабораторіях.

Паразитологічні лабораторії - науково-практичні й практичні діагностичні установи, в яких здійснюються макроскопічні, мікроскопічні та імунологічні до­слідження з метою діагностики паразитарних хвороб. Їх організація і устаткування принципово мало відрізняються від оснащення бактеріологічних лабораторій. Обов'язково мають бути мікроскопи з окулярними мікрометрами та нагрівальни­ми столиками.

Макроскопічні методи дослідження полягають у виявленні паразитів на зовнішніх покривах хворого або в його випорожненнях. За допомогою мікрос­копічних методів виявляють збудників у мазках крові, інших біологічних ріди­нах, шматочках м'язів, взятих при біопсії, а також у харкотинні, фекаліях та інших виділеннях. Останнім часом досить широко використовують імунологічні методи діагностики паразитарних хвороб, особливо аскаридозу, трихінельозу і ехінококозу.

Для попередження проникнення паразитів із досліджуваних матеріалів у рот необхідно користуватися піпетками з гумовими грушами. При дослідженні фе­калій препарати з них слід виготовляти у витяжній шафі.

Весь заразний і відпрацьований матеріал треба кип'ятити, автоклавувати або обробляти дезінфікуючим розчином.

Імунологічні лабораторії виникли лише в другій половині ХХ століття. До цього серологічні дослідження проводили в звичайних бактеріологічних лабора­торіях. Бурхливий розвиток імунології, розробка оригінальних методик і діагнос­тичних тестів призвели до створення спеціальних імунологічних лабораторій, які можуть бути самостійними структурними одиницями або існувати в складі мікро­біологічних лабораторій. Вони оснащуються термостатами, холодильниками, цент­рифугами, спеціальним посудом і приладами чи пристроями для проведення іму­нологічних реакцій у великих кількостях.

У сучасних імунологічних лабораторіях визначають біля 30 показників гу­морального й клітинного імунітету (кількість Т- і В-лімфоцитів, концентрації ос­новних класів імуноглобулінів, фагоцитарна реакція лейкоцитів, реакція бласт- трансформації лімфоцитів, циркулюючі імунні комплекси та ін.).

Для діагностики багатьох бактерійних, вірусних, паразитарних і протозойних хвороб широко використовують різні варіанти реакцій аглютинації, преципітації, нейтралізації, зв'язування комплементу, імунофлуоресценції, імуноелектрофорезу, радіоімунного та імуноферментного аналізу тощо.

При проведенні бактеріологічних і вірусологічних досліджень у лабораторіях відповідного профілю співробітники повинні дотримуватись протиепідемічного режиму і встановлених правил роботи:

1. До роботи в бактеріологічній (вірусологічній) лабораторії допускаються особи, які обізнані з правилами роботи в ній.

2. Кожен співробітник повинен працювати лише на закріпленому за ним ро­бочому місці.

3. Персонал лабораторії повинен мати індивідуальний спецодяг (халат, ша­почку, взуття). У боксі працюють у стерильних халатах, шапочках і марлевих мас­ках. При зараженні й розтині тварин одягають ще й фартух, нарукавники й гумові рукавички.

4. Курити, вживати їжу й зберігати харчові продукти в лабораторії категорич­но заборонено.

5. Матеріал, що надходить у лабораторію для дослідження, завжди вважають заразним, його обов'язково записують у спеціальному журналі і маркірують.

6. Відпрацьовані культури мікробів і заразні матеріали підлягають обов'язко­вому щоденному знищенню. Робочі столи і використані інструменти дезінфікують.

7. Переливати рідини, які містять патогенні мікроорганізми, необхідно над посудиною з дезінфікуючим розчином. При набиранні таких рідин у піпетки по­трібно користуватися гумовими балонами або грушами.

8. Коли при розбиванні колби чи пробірки заразний матеріал або жива куль­тура потрапляє на робочий стіл, інші меблі, одяг, руки, підлогу, треба негайно повідомити про це завідувача лабораторії або лікаря-бактеріолога і в його присут­ності провести дезінфекцію заражених ділянок, потім обробити руки дезрозчи- ном і ретельно їх вимити.

9. У лабораторії не дозволяються зайві ходіння, різні рухи, непотрібні розмо­ви. Виконання цих вимог попереджує проникання сторонніх мікробів із повітря й ротової порожнини в досліджуваний матеріал.

10. Необхідно завжди уникати втрат і виносу з лабораторії заразного матері­алу, живих культур та інфікованих тварин. Усі термостати, рефрижератори та сей­фи з культурами потрібно обов'язково пломбувати. Контролює виконання цих правил завідувач лабораторії або лікар-бактеріолог.

11. Музейні або виділені культури, якщо це необхідно, зберігають в агарових стовпчиках під вазеліновим маслом або в запаяних ампулах у ліофілізованому стані.

Після закінчення роботи столи дезінфікують, проводять вологе прибирання лабораторії з використанням дезінфікуючих розчинів. Предмети, матеріали, інструмен­ти, інфіковані під час роботи, збирають у баки (відра) і в той же день стерилізують

.Правила поводження з живими культурами, виділеними в процесі досліджен­ня, а також із музейними штамами мікроорганізмів, залежно від ступеня їх пато­генності, регламентуються відповідними інструкціями.

Робота в лабораторіях, де проводять мікробіологічну діагностику особливо небезпечних інфекцій, вимагає ще більш жорсткого протиепідемічного режиму. Перед входом до лабораторії в гардеробній з індивідуальними шафами співробіт­ники знімають верхній одяг і білизну.

Залежно від об' єму і характеру роботи одягають один із чотирьох типів про­тичумних костюмів у певній послідовності: піжама, шкарпетки, тапки, капюшон (косинка), протичумний халат, чоботи. Респіратор (маску) одягають так, щоб зак­рити рот і ніс, закладають ватні тампони з обох боків носа, потім надівають окуля­ри, гумові рукавички, за пояс халата з правого боку закладають рушник, змочений у дезрозчині.

По закінченні роботи руки в рукавичках занурюють у 5 % розчин лізолу на 2 хв. Протичумний костюм знімають у зворотній послідовності, за винятком ру­кавичок, які, не знімаючи з рук, занурюють у ємкість із дезінфікуючим розчином після зняття кожного предмета одягу і знімають останніми. Одяг складають зовн­ішньою стороною всередину і дезінфікують або автоклавують. Окуляри поміща­ють у 70 % спирт.

Після розтину трупів тварин усі інструменти кип'ятять у розчині лізолу про­тягом 40 хв, а самі трупи та відпрацьовані матеріали спалюють або автоклавують.

Розділ 2