Тема VI. Культура гаплоидных клеток. Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни и яблони.

Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара го-мологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моно-плоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные осо-бенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплои-дов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гап-лоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение. Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридиза-цию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений. Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на пи-тательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядерных вакуо-лизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тет-рад и готовятся к первому митозу. Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из ци-токининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тка-ней в питательные среды добавляют активированный уголь. Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4–6о С в течение 2–8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, ли-бо при слабом освещении при температуре 25 + 2о С. ]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоид-ныи зародыш (сначала образуется 40–50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные разви-тию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогор-монов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотех-нологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики. В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогене-зом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к проли-ферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, про-бирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.

Ход работы. 1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого по-местить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5–6 раз) сте-рильной дистиллированной водой. 2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, ос-торожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей. 3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверх-ность питательною среды в пробирки по 5–10 пыльников в каждую. 4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26о С и влаж-ностью 70 %. 5. Результаты работы зарисовать через 2–4 недели.

Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ ПЫЛЬЦЕВЫХ КАЛЛУСОВ ВИШНИ.

Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, со-держащие кинетин – 0,1–0,3 мг/л, ГК – 4 мг/л, 6-БАП – 0,5–1,5 мг/л, ИУК – 0,5–1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивно-стью освещения 2–3 кLх. Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверх-ность, молочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет. Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена круп-ными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чере-дуются с меристематическими участками. Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регене-рации: МС + кинетин – 1–2 мг/л, 6-БАП – 3–6 мг/л, аденин – 1–2 мг/л, ГК – 1–2 мг/л, феруловая кислота – 0,5–0,7 мг/л, ИУК – 0,2–0,4 мг/л, НУК – 0,2–0,4 мг/л, ИМК – 0,2–0,4 мг/л, 2,4-Д – 0,1–0,3 мг/л. Через 1,5–2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часо-вом фотопериоде при освещенности 3 кLх начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4–6 недель. Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. По-этому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получе-ния морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препариро-вальные иглы, пинцеты.

Ход работы. 1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности). 2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5–6 мм) морфо-генного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку сте-рильной пробкой. 3.Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2о С, влажностью 70 %, освещенностью 4 кLх. 4. Через 4–6 недель зарисовать результаты работы. 5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1–2 мг/л 6-БАП, 1 мг/л НУК. 6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1–2 мг/л ИМК + 1мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.

Контрольные вопросы к теме VI. 1. Для чего используются гаплоиды в селекции и генетике? 2. Как получить морфогенный каллус из пыльников? 3. Каковы основные способы получения гаплоидных и дигаплоидных рас-тений-регенерантов?

ТЕРМИНОЛОГИЯ

In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях. Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма. Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток расте-ний всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической инфор-мации. Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной куль-туре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений. Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов. Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной пи-тательной среде в пересадочном режиме изолированных корней. Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями. Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выра-щивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде. Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных заро-дышей. Апекс – верхушечная часть стебля или корня. Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клет-ками. Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек по-бега в присутствии терминальной почки. Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обыч-но их не образующих. Фитогормоны – (гормоны растений) – биолигически активные соединения, образующиеся в раститениях в малых количествах, вызывающие специфиче-ский ростовой или формообразовательный эффект. Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеб-лей и корней, стимулирующие образование корней у проростков. Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие меристем, стимулирующие образование почек. Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вы-зывающие прорастание семян. ГК – гибберелловая кислота ИУК – b-индолилуксусная кислота НУК – a-нафтилуксусная кислота 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 6-БАП – 6-бензиламинопурин Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – полу-чение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro). Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса. Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации). Редифференциация – переход специализированных клеток из одного со-стояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непо-средственно. Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками. Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других. Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro. Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней. Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, орга-на. Эмбриоидогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эм-бриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro. Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in vitro путем неорганизованной пролиферации. Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной куль-туре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток, тканей, органов растений. Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и спо-собных расти на питательных средах без гормонов. Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду. Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на све-жую питательную среду. Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в культуральный сосуд на свежую питательную среду. Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма или кал-лусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивиро-вания. Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращива-ния, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмиче-ского роста), замедления роста, стационарная, деградации. Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и со-стоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса. Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки. Клон – культура, возникшая из одной клетки. Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сома-клональных вариаций с помощью селективных условий. Сомаклональные вариации и варианты – фенотипическое выражение непо-стоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируе-мых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой воз-никновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хро-мосом, геномов). Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциаль-ной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка-растение-клетка. Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибрид-ных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла, на-пример путем слияния изолированных протопластов. Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного или механического разрушения. Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший при фрагментации изолированного протопласта. Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплаз-мы, сохранивший ядро. Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран. Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополни-тельного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в опти-мальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолирован-ные протопласты превращаются в культуру клеток. Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изоли-рованных протопластов. Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеирован-ным протопластом. Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида. Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным числом хромосом в полиплоидной серии (символ Х). Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду (символ n). Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного вида (символ 2n). Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу. Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным ос-новным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.). Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х. Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х. Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности организма. Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом не-сут данные гены. Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомоло-гичные наборы имеют разные гены.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1. Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.

Таблица 2 Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур

Таблица 3 Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля

Таблица 4 Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для микроразмножения картофеля черенкованием побегов

Таблица 5 Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.

Таблица 6 Среда Гамборга-Эвелега

Таблица 7 Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для клубнеобразования у картофеля.

Таблица 8 Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.

Таблица 9 Среда Блейдза для каллусогенеза.

Таблица 10 Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост растений и природные регуляторы – М.: Наука, 1977. 2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука, 1986. 3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 4. Гамбург К.3., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тка-ней и клеток растений – Новосибирск: Наука, 1990. 5. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений – Киев: Нау-кова думка, 1984. 6. Калинии Ф.Л., Бутенко Р.Г. Методы культуры тканей в физиологии рас-тений – Киев: Наукова думка, 1980. 7. Калинин Ф.Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В.В. Технология микрокло-нального размножения растений – Киев: Наукова думка, 1992. 8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М.: Наука, 1983. 9. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин // Биортехнология. Т. З. – М.: Высшая школа, 1987. 10. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: Методические указания / Сост. Г.М. Артамонова, С.И. Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. Москва: Изд-во МСХА, 1991. 11. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодо-водстве и цветоводстве / Сб. науч. трудов ВНИИГиСП – Мичуринск, 1989. 12. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Порофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологий. – М: Наука, 1990.