Инструкция к практическому занятию тема: коринебактерии дифтерии и микобактерии туберкулеза

ЦЕЛЬ:

• Изучить методы выявления туберкулезной палочки.

• Специфическая профилактика туберкулеза.

• Изучить методы выявления палочки Леффлера.

• Специфическая профилактика дифтерии.

• Закрепить навык работы с микроскопом.

Задание № 1 Методы выявления туберкулезной палочки

Туберкулез – хроническая инфекция, при которой поражаются легкие, кишечник, почки, твердая мозговая оболочка, кости, кожа, другие органы и системы.

Чаще всего у людей наблюдается туберкулез легких.

При заболеваниях, вызванных микобактерией туберкулеза в лабораторию доставляется следующий материал: мокрота, гной, моча, спинномозговая жидкость, испражнения, промывные воды бронхов.

Подготовительный этап:

1. Подготовить рабочее место согласно правил работы в бактериологической лаборатории.

2. Подготовить емкости с дез. растворами для обеззараживания предметов, используемых в процессе работы, согласно инструкции.

Основной этап:

1. Бактериоскопическое исследование. Мокроту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверхность стола, выбирают гнойные комочки, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Спинномозговую жидкость для образования пленки фибрина и фиксации в ней микобактерий туберкулеза оставляют на сутки в холодном месте. Затем ее осторожно распределяют на предметном стекле. Мочу центрифугируют и микроскопируют осадок.

Мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко красный цвет, имеют вид тонких, длинных, слегка изогнутых или коротких, прямых, сплошных или зернистых палочек. Располагаются они по одиночке, попарно или небольшими скоплениями.

Если в материале находится небольшое количество микобактерий и в обычных мазках их нельзя обнаружить, применяют методы обогащения: (концентрирование микобактерий туберкулеза в небольшом объеме).

• Метод гомогенизации. Суточную порцию мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1% водного раствора натрия гидроксида, плотно закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают до полной гомогенизации (10-15 мин.). Утратившую вязкость мокроту центрифугируют, жидкость сливают, осадок нейтрализуют добавлением 2-3 капель 10% соляной или 30% уксусной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену.

• Метод флотации. Ту же мокроту подвергают щелочной гомогенизации и для полного растворения оставшихся слизистых комочков помещают на 30 минут на водяную баню при 55⁰С. Затем к ней добавляют 1-2 мл ксилола (бензола, бензина) и встряхивают в течение 10 мин, затем отстаивают 20 мин при комнатной температуре. Капельки ксилола с адсорбированными микобактериями всплывают, образуя сливкообразный слой, его снимают пипеткой и несколько раз наносят по мере высыхания на предметное стекло, помещенное на стеклянную пластинку, нагретую над водяной баней до 60⁰С.

Для быстрой диагностики туберкулеза применяют люминесцентную микроскопию. Препарат окрашивают аурамином в разведении 1:1000, после чего обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином, который «гасит» свечение элементов тканей и слизи. Туберкулезные микобактерии светятся ярким золотисто-зеленым светом на темном фоне.

2. Бактериологическое исследование. Выделить культуру микобактерий туберкулеза удается при наличии в 1 мл исследуемого материала даже 20-100 микробных тел. При этом определяют ее устойчивость к лекарственным препаратам, а при необходимости – и вирулентность.

Получая чистую культуру микобактерий туберкулеза из мокроты, к ней в целях уничтожения от кислотоподатливой микрофлоры добавляют двойной объем 6 % серной кислоты, встряхивают в течение 10 мин, центрифугируют в стерильной пробирке. Затем жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1-2 каплями 3 % натрия гидроксида или несколько раз отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Фекалии обрабатывают 4 % раствором натрия гидроксида, смесь помещают в термостат на 3 ч, центрифугируют и осадок нейтрализуют 8 % соляной кислотой.

Нейтрализованные осадки мокроты и фекалий по инструкции ВОЗ засевают на скошенную в пробирках яичную среду Левенштейна-Йенсена, содержащую аспарагин, комплекс солей, необходимых микобактериям туберкулеза, и малахитовый зеленый, угнетающий рост банальной микрофлоры.

Спинномозговая жидкость, экссудат, гной, кровь кислотно-щелочной обработке не подвергаются, их засевают на среду Левенштейна - Йенсена пипеткой с последующим втиранием бактериальной петлей. Ватные пробирки, которыми закрывают засеянные пробирки, заливают парафином, чтобы избежать высыхания среды. Посевы помещают в термостат при температуре 37⁰С и выдерживают в течение 6-8 недель. Хороший рост микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена получают на 15-25 сутки. Колонии микобактерий туберкулеза морщинистые, суховатые, с неровными краями, напоминают бородавки.

Устойчивость микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам определяют методом их серийных разведений в среде Левенштейна-Йенсена перед ее свертыванием. При этом засевают как исходный материал, содержащий не менее 5 микобактерий в поле зрения (прямой метод), так и выделенную культуру (непрямой метод).

3. Биологическое исследование. Животных (в частности, морских свинок) заражают для выделения чистых культур микобактерий туберкулеза и изучения патогенеза заболевания. Однако поскольку большинство изониазидустойчивых штаммов утратили к ним вирулентность, биологический эксперимент в настоящее время не находит широкого применения. После инфицирования подкожно морскую свинку через 2-3 недели взвешивают, определяют размеры регионарных лимфатических узлов и ставят реакцию Манту, которую повторяют через 6 недель. При отрицательных реакциях животное убивают через 4 месяца, исследуют макро- и микроскопически печень, селезенку, легкие, лимфатические узлы, а также делают посев на среду Левенштейна-Йенсена. О вирулентности штаммов судят по количеству специфических изменений в органах (бугорки), продолжительности жизни животного и уменьшению массы его тела.

Аллергический метод. Применяют главным образом для определения инфицирования людей микобактериями туберкулеза. Для этого ставят внутрикожную пробу Манту с туберкулином. Реакцию учитывают через 24-48ч по диаметру инфильтрата и гиперемии на месте введения туберкулина. Отрицательная реакция Манту у больных туберкулезом указывает на отсутствие иммунитета. Положительная реакция Манту у больных детей может являться диагностическим тестом туберкулезного процесса.

Серологический метод. В серодиагностике используется РНГА. В качестве антигена берут сенсибилизированные экстрактом туберкулезных микобактерий или очищенным туберкулином эритроциты барана или человека О -группы, отмытые от избытка антитела. Сыворотку больного, предварительно истощенную взвесью интактных эритроцитов для устранения неспецифических антител, разводят, начиная с 1:2, 1:4, 1:8 и далее. Диагностический титр сыворотки 1:8 регистрируется у 70-90% больных туберкулезом людей.