Задание № 6

6.1. Изучите принцип постановки и учёт реакции связывания комплемента (рск)

В РСК помимо антигена и антител принимает участие третий компонент – комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. РСК позволяет выявить антигены при наличии к ним антисывороток или антитела с помощью антигенов-диагностикумов.

Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождается видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической антибараньей антисывороткой. Эту антисыворотку предварительно прогревают при температуре 56ºС в течение 30 мин для разрушения ее комплемента. В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис этих эритроцитов.

Принцип метода состоит в том, что если в опытной системе образовался комплекс антиген-антитело, который связал добавленный комплемент, то не будет лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе (РСК положительная, выявлен антиген или антитело). Если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется, комплемент остается свободным, взаимодействует с гемолитической системой и вызывает лизис эритроцитов (РСК отрицательная, есть гемолиз). РСК лежит в основе реакции Вассермана, которая применяется для диагностики сифилиса.

Задание № 7

7.1. Изучите принцип постановки и учёт реакции реакции нейтрализации экзотоксинов и вирусов

Реакция нейтрализации экзотоксина происходит при его взаимодействии с антитоксической сывороткой (антитела-антитоксины). В результате образования комплекса антиген-антитело токсин теряет свои ядовитые свойства.

Реакцию нейтрализации проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов.

Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной среды или исследуемого материала, где размножались токсигенные бактерии. При обработке формалином в течение 30-45 дней при температуре 37ºС токсин превращается в анатоксин, который используют для иммунизации животных с целью получения антитоксической сыворотки.

Реакция нейтрализации вирусов

Данная реакция используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если антитела соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается. И индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним.

Задание № 8

8.1.Изучите методы, основанные на использовании меченых антигенов и антител Методы, основанные на использовании меченых антигенов и антител

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют флюоресцентные красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

Иммунофлюоресцентные методы. Прямой метод иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флюорохрома используют флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ). Он дает зеленое свечение в ультрафиолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоционат - оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с антителами, меченными ФИТЦ, инкубируют, отмывают и, при положительном результате, учитывают свечение в люминесцентном микроскопе.

Непрямой метод иммунофлюоресценции заключается в том, что первоначально антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, которую получают путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном. Для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют меченую флюорохромом антисыворотку против иммуноглобулинов кролика. Такую сыворотку получают путем иммунизации барана иммуноглобулинами кролика. Непрямой метод дает возможность обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченой антиглобулиновой сыворотки.

Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации бактерий, риккетсий, вирусов, а также для определения рецепторов и антигенов клеток человека и животных.

Иммуноферментный анализ. В методах иммуноферментного анализа (ИФА) используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела.

Для выявления антител известные антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления не связавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (водорода пероксид) и хромоген (орто-фенилендиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстракта. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. Для регистрации окраски используют специальные спектрофотометры с вертикальным ходом луча (мультисканы).

Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины. В клинической диагностике с помощью фиксированных на твердой фазе антител, в том числе моноклональных, определяют концентрации лекарственных препаратов в организме, присутствие антигенов раковых клеток, микроорганизмов и т.д. Используя твердофазные носители с антигенами выявляют антитела к различным видам бактерий, вирусов, простейших. Так, планшеты с соответствующими адсорбированными антигенами служат для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатитов и др.

Радиоиммунологический анализ. Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода ( ¹²⁵I ¹³¹I). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков γ-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая не безопасность работы с радиоактивными изотопами.