1.6. Хроматографические методы разделения и анализа пищевых продуктов

Хроматографические методы анализа пищевого сырья и продуктов. Классификация хроматографических методов. Параметры удерживания. Основное уравнение хроматографии. Критерий разделения. Фактор разделения.

Газовая хроматография. Качественные и количественные определения. Высокоэффективная газожидкостная хроматография (ВЭГЖ). Тонкослойная хроматография. Примеры хроматографических определений для разделения и анализа пищевых смесей.

При изучении материала этого подраздела студентам необходимо обратить особое внимание на примеры использования хроматографических методов для исследования состава пищевых продуктов. Студенты должны изучить принципы метода, знать классификацию хроматографических методов анализа и область их применения.

Хроматографией называется процесс разделения веществ, основанный на распределении компонентов смеси между неподвижной (стационарной) и подвижной (мобильной) фазами. Таким образом, хроматографию можно определить как метод разделения смеси веществ, основанный на многократно повторяющемся процессе перераспределения компонентов между двумя несмешивающимися фазами.

Современные хроматографические методы разделения широко применяются благодаря высокой эффективности (в течение нескольких минут можно разделить смесь из 10–20 компонентов), возможности разделения сложных природных смесей (витаминов, терпенов и т. д.), относительной простоте оборудования. Они позволяют разделять органические соединения, имеющие сходные структуры, и неорганические соединения с близкими химическими свойствами.

Разделение компонентов образца в хроматографии связано с распределением их между двумя несмешивающимися фазами. Одностадийным процессом такого разделения является экстракция.

Хроматографические методы анализа классифицируют по системе несмешивающихся фаз, принципу разделения, по форме проведения процесса, способу проведения эксперимента и другим признакам.

По форме проведения процесса различают колоночную, бумажную (БХ) и тонкослойную (ТСХ) хроматографию. В колоночной хроматографии разделение проводится на хроматографической колонке; в бумажной хроматографии разделение осуществляют на специальной фильтровальной бумаге; в тонкослойной – на стеклянной или пластмассовой пластинке, на которую нанесен адсорбент.

Хроматографическое разделение можно вести тремя способами: фронтальным, вытеснительным и элюентным анализом.

Фронтальный анализ предусматривает непрерывный ввод в колонку разделяемой смеси (например, А + В + С). При этом из колонки сначала выходит чистый растворитель, затем компонент А, обладающий самым малым сродством с неподвижной фазой и поэтому слабее удерживающийся. Затем выходит смесь компонентов А + В и, наконец, когда неподвижная фаза насыщается компонентом С, выходит раствор, содержащий смесь всех трех компонентов. Постоянно следя за изменением какого-либо свойства выходящего раствора (например, коэффициента преломления), можно провести качественный и даже количественный анализ смеси. Однако для разделения веществ фронтальный анализ непригоден, так как в чистом виде удается выделить лишь часть одного компонента А.

При проведении вытеснительного анализа в колонку вводят некоторое количество разделяемой смеси (например, А + В + С), а затем непрерывно подают раствор вещества D, обладающего наибольшим сродством с неподвижной фазой. По мере продвижения смеси через колонку компоненты вытесняют друг друга из неподвижной фазы в соответствии с их сродством с этой фазой и по очереди выходят из колонки. Последним выходит компонент D. Этот метод также не позволяет разделить все компоненты, происходит их частичное смешение, в результате чего они выходят из колонки в такой последовательности: А, А + В, В, В + С, С, С + D, D.

Чаще всего в настоящее время применяется элюентный анализ, так как он не имеет указанных недостатков фронтального и вытеснительного анализа. В этом методе порцию раствора образца в подвижной жидкости вводят в верхнюю часть колонки, а затем пропускают через колонку чистую подвижную фазу. Хроматографическое разделение этим способом основано на том, что отдельные компоненты образца имеют разное сродство с подвижной и неподвижной фазами и по мере продвижения растворителя по колонке происходят распределение и перераспределение компонентов между этими фазами. Растворитель, проходящий через колонку, называют элюентом, а процесс вымывания из колонки растворенного вещества путем пропускания чистого растворителя – элюированием.

В результате компоненты перемещаются по колонке с различной скоростью и разделяются на полосы, которые продвигаются к выходу из колонки. Если на выходе из колонки поместить детектор, реагирующий на изменение концентрации растворенного вещества, и регистрировать его показания во времени, то получится график, называемый хроматограммой. Каждый пик такой кривой соответствует отдельному компоненту, а площадь каждого пика характеризует относительное содержание данного компонента.

Основным количественным выражением скорости движения частиц через колонку служит время удерживания t_R или объем удерживания V_R. Основным количественным выражением неравномерности распределения вещества между фазами служит число теоретическим тарелок n или высота Н, эквивалентная теоретической тарелке.

Для эффективного хроматографического разделения компонентов смесей необходимо соблюдать следующие условия:

– чтобы равновесие между подвижной и неподвижной фазами устанавливалось достаточно быстро, твердый носитель должен быть пористым и состоять из небольших однородных частиц сферической формы;

– чтобы устранить влияние факторов, приводящих к расширению пиков, колонка должна быть плотно и равномерно заполнена;

– колонка должна иметь достаточное число теоретических тарелок;

– хроматографическую систему следует подобрать так, чтобы коэффициенты распределения были не слишком малы и не слишком велики. Если коэффициенты распределения малы, компоненты быстро проходят через колонку и плохо разделяются. При больших коэффициентах распределения увеличивается время элюирования и происходит расширение пиков.

В газовой хроматографии в качестве подвижной фазы используется инертный газ. Неподвижной фазой в газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) является активное дисперсное твердое вещество, а в газожидкостной (ГЖХ) – слой жидкости, нанесенный на твердый носитель.

Принципиальная схема газохроматографического анализа сводится к следующему. Через колонку, заполненную неподвижной фазой, непрерывно пропускают инертный газ, называемый газом-носителем. В этот газ у входа в колонку вносят в виде пара небольшое количество анализируемой смеси. Вследствие различий в сорбируемости или растворимости компонентов в стационарной жидкой фазе они передвигаются по колонке с различной скоростью. На выходе из колонки устанавливается детектор, регистрирующий изменение какого-либо физического свойства газового потока; при автоматизированной системе детектирования получаем хроматографическую кривую. В качестве газа-носителя обычно используют либо инертные газы (гелий, аргон, азот), либо водород.

Насадочные колонки заполняются неподвижной фазой, которая покрывает тонким слоем внутреннюю поверхность трубки. В ГАХ в качестве неподвижной фазы используют твердые полярные и неполярные сорбенты: активный уголь, силикагель, алюмосиликаты, сополимеры стирола и дивинилбензола (различные парапаки), хромосорб. В ГЖХ колонку заполняют гранулированным твердым носителем, на который наносится слой нелетучей жидкой фазы. Твердые носители – это пористые гранулированные вещества, обладающие набором свойств: химической инертностью, каталитической неактивностью, механической прочностью, термостабильностью и хорошей смачиваемостью жидкой фазой.

Большинство носителей – это диатомиты, состоящие на 90 % из SiO₂ и химически модифицированные действием разных силанов (диметилдихлорсилана, триметилхлорсилана и др.) для уменьшения адсорбционной активности.

Газовая хроматография применяется для качественного и количественного определения жирных кислот, аминокислот, спиртов, сахаров, липидов, фосфолипидов, различных ароматических веществ, обусловливающих вкус, запах и аромат плодов и овощей. Используется этот метод также для анализа загрязнений питьевой воды, пищевых продуктов (например, для определения хлорсодержащих пестицидов).

К основным достоинствам метода относятся:

– сравнительная простота аппаратуры;

– быстрота выполнения анализа. Во многих случаях на анализ сложной смеси затрачиваются минуты;

– возможность определения с большой точностью микроколичеств веществ, не определяемых другими методами;

– легкость автоматизации анализа, что позволяет использовать его для оперативного контроля производственных процессов.

Метод жидкостной хроматографии распространен довольно широко благодаря большому числу разновидностей. В настоящее время различают бумажную, тонкослойную, колоночную жидко-жидкостную и жидко-твердофазную (адсорбционную) хроматографию, а также хроматографию высокого давления, которая представляет собой наиболее прогрессивный метод разделения и является разновидностью адсорбционной хроматографии.

Бумажная хроматография. В данном методе разделение смесей происходит на специальной хроматографической бумаге, изготовленной из особо чистой целлюлозы. Этот метод применяется для идентификации и разделения очень малых количеств веществ. Особенно широкое применение он получил в биохимии, где часто приходится разделять сложные смеси очень близких по свойствам соединений. Для этого бумагу обрабатывают реагентом, дающим с разделяемыми компонентами окрашенные соединения, компоненты при этом проявляются в виде пятен.

Для количественного анализа методом БХ пятна компонентов вырезают вместе с участком бумаги, помещают в подходящий раст-воритель и полностью экстрагируют, затем колориметрируют или фотометрируют.

Кроме обычной, одномерной, используют и двухмерную БХ. Этим методом разделяют смеси, не разделяемые при помощи одного растворителя.

Метод бумажной хроматографии используется для разделения всех классов органических соединений. Лучшие результаты достигаются при разделении сахаров, фенольных соединений, сложных смесей аминокислот, пептидов, алкалоидов, антибиотиков и т. д.

Достоинства метода:

– исключительная простота выполнения;

– небольшое количество образца (примерно несколько микрограммов), следовательно, высокая чувствительность.

Недостатки:

– трудоемкость;

– не является экспресс-методом, требует основательной пробоподготовки.

Примеры применения:

– определение фенольного состава копченых продуктов;

– определение сахаров (двухмерная хроматография);

– определение аминокислот.

Тонкослойная хроматография. С точки зрения методических особенностей эксперимента ТСХ является наиболее простым методом хроматографии, сочетающим такие качества, как универсальность, высокая чувствительность, быстрота и простота выполнения анализа. Благодаря этим качествам, а также несложности оборудования, наглядности, четкому разделению, надежности идентификации метод ТСХ предоставляет широкие возможности для экспресс-анализа пищевых продуктов.

Тонкослойную хроматографию можно рассматривать как разновидность БХ. Вместо свободно свисающих полос бумаги используют стеклянные пластинки, на которые тонким слоем наносят подходящий сорбент, или уже готовые подложки с закрепленным на них слоем сорбента. На стартовую линию такой пластинки наносят анализируемую смесь веществ, край погружают в систему растворителей ниже стартовой линии. По мере продвижения жидкости по пластинке происходит разделение смеси веществ благодаря действию сил адсорбции, распределения, ионообмена или совокупности действия всех перечисленных факторов.

Примеры применения ТСХ:

– определение фракционного состава липидов (фосфатиды, моно- и диглицериды, стерины, свободные жирные кислоты, триглицериды, углеводороды и др.);

– фракционирование фосфолипидов (на силикагеле);

– витамины (жирорастворимая группа): разделение и идентификация каротиноидов в плодах и овощах; определение изомерных форм токоферолов в растительных маслах;

– определение остаточных количеств пестицидов: определение хлорофоса в овощах, фруктах, зерне, молоке, мясе (силикагель);

– определение трикарбоновых кислот в плодах и овощах (на целлюлозе);

– разделение углеводов (целлюлоза, силикагель);

– разделение аминокислот;

– разделение микотоксинов (афлатоксинов).

Адсорбционная хроматография – старейший хроматографический метод, основан на различии в равновесном распределении компонентов смеси между неподвижной фазой (адсорбентом) и подвижной жидкой фазой. Это распределение зависит от характера и прочности адсорбции каждого компонента, которые, в свою очередь, определяются природой адсорбента, адсорбируемого вещества и подвижной фазы.

Для выбора условий хроматографического разделения и анализа смеси веществ большое значение имеет знание изотермы адсорбции каждого из компонентов разделяемой смеси. Изотермы адсорбции выражают зависимость количества адсорбированного вещества от его концентрации в растворе при состоянии равновесия и постоянной температуре.

На поверхности адсорбента находятся активные центры, способные фиксировать молекулы адсорбированного вещества. Каждой элементарный участок поверхности способен фиксировать только одну молекулу, в результате чего на поверхности адсорбента образуется мономолекулярный слой. Процесс адсорбции – обратимый. Между поверхностью адсорбента и средой устанавливается адсорбционное равновесие. При выводе изотермы адсорбции предполагается, что адсорбируемая молекула должна удариться о поверхность адсорбента и попасть на незанятое место. Сила ударов о поверхность адсорбента пропорционально концентрации вещества в растворе С, а вероятность попадания на незанятое место равна числу этих мест.

В качестве адсорбентов используются силикагель, оксид алюминия, сульфат магния, древесный уголь, полиамид. Размер частиц адсорбента составляет 0,05–0,5 мм; удельная площадь поверхности – 100–600 м²/г. При адсорбции на адсорбентах полярного типа (оксидах, солях) главную роль играют дипольные взаимодействия. Адсорбция на адсорбентах неполярного типа (древесном угле) возможна благодаря дисперсионным взаимодействиям между твердой фазой и недиссоциированными молекулами.

Принципы выбора адсорбентов и элюирующих смесей аналогичны тонкослойной хроматографии.

В настоящее время разработан и быстро развивается метод высокоскоростной хроматографии, или хроматографии высокого давления. При этом методе элюент пропускают через колонку со скоростью, в 100 раз превышающей его скорость при обычной, колоночной, хроматографии, для чего используют насос или газ, находящийся под высоким давлением. Для того чтобы быстро установить равновесие, размер частиц твердого носителя должен быть очень мал (5–50 мкм).

Методом высокоскоростной хроматографии достигается эффективное разделение наноколичеств смесей, в несколько раз увеличивается разрешающая способность колонки. Для разделения требуется всего несколько минут, хроматограммы прекрасно воспроизводятся.

Особенно ценно использование адсорбционной хроматографии для качественного и препаративного разделения и очистки различных веществ при анализе пищевых продуктов. Этим методом пользуются при определении каротиноидов, антоцианов, катехинов, стеринов, витаминов, для фракционирования липидов и фосфолипидов.

Кроме описанных выше основных типов хроматографии, следует также кратко рассмотреть гель-хроматографию и аффинную хроматографию.

Гель-хроматография – это метод разделения веществ, основанный на различии в размерах молекул. Нерастворимую фазу образует гель, представляющий собой химически инертное пористое вещество, насыщенное жидкостью, обычно водой. Кроме гидрофильных могут использоваться и гидрофобные гели, способные набухать в органических растворителях. Те же растворители при этом служат и под-вижной фазой.

В зависимости от типа гель имеет различный размер пор. Раствор смеси соединений, различающихся по размерам молекул, подают в колонку, заполненную гелем, а затем элюируют чистым растворителем. Молекулы отдельных компонентов стремятся диффундировать из раствора внутрь твердой фазы. Для этого они должны пройти через отверстия пор. Большие молекулы не могут проникнуть в поры геля и проходят по колонке вместе с растворителем. Маленькие молекулы проникают внутрь пор и распределяются в обеих фазах, а молекулы среднего размера частично диффундируют внутрь геля, но в основном остаются в жидкой фазе. Молекулы, попавшие внутрь геля, элюируются медленнее всех и выходят из колонки последними.

Гель-хроматография находит широкое применение в синтетической органической химии, для фракционирования пептидов, ферментов, белков, для обессоливания растворов высокомолекулярных соединений (например, при разделении гемоглобина и хлорида натрия).

Аффинная хроматография – особый метод, предназначенный для выделения из смесей биологически активных соединений и основанный на специфических взаимодействиях, присущих некоторым биологическим и биохимическим процессам. Так, например, фермент реагирует только со своим субстратом или с ингибитором; транспортная рибонуклеиновая кислота «выбирает» только ту аминокислоту, которую она может перенести внутрь рибосомы; гормон реагирует с соответствующим рецептором и т. п. Одно из соединений подобной пары, называемое аффинным лигандом, присоединяется обычной ковалентной связью к носителю, представляющему собой неподвижную фазу колонки. При пропускании через колонку раствора, содержащего второе соединение пары, это соединение избирательно связывается аффинным лигандом. Сорбированное вещество можно затем элюировать, используя либо растворимый аффинный лиганд, либо растворитель, вызывающий диссоциацию образующегося специфического комплекса.

Аффинная хроматография применяется для выделения ферментов, их ингибиторов, антител, нуклеиновых кислот, транспортных и репрессорных белков, гормонов и других соединений.

Работа с основной литературой – [1, 3]; дополнительной – [1, 5].

Контрольные вопросы

1. Что такое хроматография?

2. Перечислить основные методы хроматографии?

3. Перечислить основные виды хроматографического анализа.

4. Газовая хроматография. Основные принципы и примеры применения для разделения и анализа пищевых смесей.

5. Абсорбционная хроматография. Основные принципы и примеры применения для разделения и анализа пищевых смесей.

6. Бумажная хроматография. Основные принципы и примеры применения для разделения и анализа пищевых смесей.

7. Тонкослойная хроматография. Основные принципы и примеры применения для разделения и анализа пищевых смесей.

8. Другие виды хроматографии и примеры их использования.