2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

Свойства генетического кода

1)Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из 3 нуклеотидов. Минимальное количество нуклеотидов, способное обеспечить кодирование 20 протеиногенных аминокислот –

3.(42=16 – недостаточно, 43=64 – даже избыточно).

2)Вырожденность (избыточность) – одну и ту же аминокислоту кодирует несколько триплетов. Первый и последний нуклеотиды триплета могут варьировать, средний всегда неизменен. Эту особенность генетического кода можно расценить как защиту от возможных последствий повреждений генетического кода. Если бы каждая аминокислота кодировалась только одним кодоном, то его повреждение обязательно вызвало бы нарушение структуры синтезируемого белка. Наличие нескольких вариантов триплетов уменьшает вероятность таких нарушений.

3)Наличие инициирующих кодонов (АУГ и ГУГ). Они коди-

руют включение в полипептидную цепь формилметионина у прокариот и метионина у эукариот.

4)Наличие терминирующих кодонов (УАА, УАГ, УГА). Они указывают место завершения синтеза полипептидной цепи и не кодируют аминокислот.

5)Неперекрываемость. Нуклеотид входящий в состав одного триплета не может входить в состав соседнего (при кодировании одного белка).

6)Однонаправленность считывания. Направление считывания

информации всегда одинаково – 5’ 3’.

7)Специфичность. Один триплет соответствует одной аминокислоте.

8)Универсальность. У всех живых организмов аминокислоты кодируются одинаковым кодом. Исключение составляют 4 триплета в митохондриальной ДНК. Это, вероятно, обусловлено малым размером генома митохондрий. Поскольку изменения не затрагивали важных белковых структур, то они закреплены в кольцевом геноме. В ядре такие изменения могли бы быть летальными.

9)Колинеарность. Соответствие последовательности аминокислот в белке, последовательности кодонов в РНК.

Трансляция

1. Необходимые компоненты и их краткая характеристика

1)и-РНК.

2)полный набор т-РНК.

3)Рибосомы.

302

4)АТФ, ГТФ, ионы Mg++.

5)Ферменты аминоацил-т-РНК-синтетазы и пептидилтрансфе-

раза.

6) Ряд вспомогательных белковых факторов.

и-РНК. и-РНК прокариот и эукариот схожи. Однако есть и существенные отличия. У эукариот и-РНК имеет 5’-«кэп». Он состоит из 7-

метилгуанозина и двух метилированных по рибозе нуклеотидов. За ними следуют: инициаторный кодон АУГ или ГУГ (кодируют метионин), структурные кодоны (кодируют последовательность аминокислот в белке), терминальные кодоны (УАА, УАГ, УГА – останавливают трансляцию) и полиадениловая последовательность.

	участок связывания
5Ä		рибосомы			терминирующий
					кодон
МЕТG	Р Р	Р	А У Г	структурные кодоны	У А А	Poly à A
	«Кэп»		инициаторный кодон

Прокариотическая и-РНК не имеет 5’-«кэп» участка и полиаде-

ниловой последовательности. Инициаторным кодонам (АУГ), как правило, предшествуют специфические, шестинуклеотидные инициаторные последовательности.

				Участки связывания				терминирующий
				рибосом					код
5Ä
P	P	P	A У	Г структурные кодоны		А	У	Г	структур-
									ные кодоны
	инициаторны			стинуклиотидные	рные				иаторный
				последовательности					кодон

Уэукариот инициаторный комплекс, предшествующий сборке рибосомы, опознает именно 5’-«кэп» и следующий за ним инициатор-

ный кодон (АУГ), а затем присоединяется к ним. Ни один другой АУГ

–кодон по ходу молекулы и-РНК не может быть местом начала синте-

за белка. Поэтому у эукариот синтезируется только 1 белок на основании 1 молекулы и-РНК.

Упрокариот рибосома находит специ-

фические	шестинуклеотидные	последова- 1.	АА Ц У Ц А А Г А Ц
тельности		2.
	и начинает синтез белка с бли- Последовательность 1:
жайшего инициаторного АУГ		кодона. По- асн-лей-лиз-асн...
		Последовательность 2:
		лей-лиз-тре...

303

скольку таких последовательностей может быть несколько, то происходит так называемый сдвиг рамки считывания. В результате на основе одной молекулы и-РНК прокариот может синтезироваться несколь-

ко различных белков. Значение полиадениловой последовательности достоверно не известно. Предполагают, что она обеспечивает связывание с белком информофером при переносе и-РНК в цитозоль, и, воз-

можно, определяет количество молекул белка, которое может быть синтезировано на данной молекуле и-РНК.

	Рибосомы. Перенос генетической ин-	Полирибосомы
	формации от и-РНК к белку осуществляется
	с помощью рибосом. Значение их для синте-
	за белка очень высоко. Именно рибосомы

определяют место начала считывания информации с и-РНК. Ошибка

определения места считывания хотя бы на 1 нуклеотид приведет к сдвигу рамки считывания и синтезу совершенно иного белка. Именно рибосомы собирают вместе все компоненты синтеза белка и обеспечивают продукцию белковой молекулы. Несколько рибосом могут одновременно считывать информацию с и-РНК, последовательно «садясь»

на нее, такие комплексы называют полирибосомами (или полисомами). Полирибосомы, локализующиеся на эндоплазматическом ретикулуме, в основном синтезируют белки мембран и экспортные белки. Цитозольные полирибосомы обеспечивают синтез белков для нужд клетки.

Рибосомы прокариот по молекулярной массе меньше чем эукариот, и поэтому, при ультрацентрифугировании имеют различные константы седиментации (константы Сведберга S – 70 и 80S соответст-

венно). Они состоят из больших и малых субъединиц. У прокариот 50S и 30S субъединицы, а у эукариот – 60S и 40S. Несоответствие сумм констант Сведберга отдельных субъединиц и целых рибосом обусловлено условиями ультрацентрифугирования (плотность растворов, объем частиц рибосом…). Соотношение р-РНК и белков у прокариот 2:1 (65% РНК и 35% белка) а у эукариот 1:1 (50% РНК и 50% белка). р-

РНК эукариот синтезируется в ядрышке в виде предшественника 45S РНК, который затем расщепляется на 5S, 5,8S и 28S р-РНК. Отдельно синтезируется 5S р-РНК. Рибосомные белки синтезируются в цито-

плазме и поступают в ядрышко. Здесь образуются рибосомы. Малая субъединица состоит из 18S р-РНК и 33 белков, большая – 5S, 5,8S, 28S р-РНК и 49 белков. У прокариот малая субъединица содержит 16S р-РНК и 21 белок, а большая – 5S, 23S р-РНК и 34 белка.

2. Механизм трансляции

Процесс трансляции условно можно разделить на 5 стадий: 1. Активации аминокислот (образование аминоацил т-РНК).

304

2.Инициации синтеза полипептидной цепи.

3.Элонгации.

4.Терминации.

5.Посттрансляционной модификации.

Активация аминокислот. В синтезе белков участвуют 20 протеиногенных аминокислот. Перед использованием они должны активироваться. Для этого они объединяются с т-РНК, образуя активное макроэргическое соединение – аминоацил-тРНК. Катализирует этот процесс аминоацил-тРНК-синтетаза. Для каждой из 20 протеиноген-

ных аминокислот существует свой специфический фермент, который способен проверять правильность присоединения аминокислоты к т-

РНК. Если присоединилась неправильная аминокислота, то такая ами- ноацил-т-РНК разрушается. Редактирующая способность аминоацил-т- РНК-синтетазы достигается благодаря ее особого строения. Фермент

имеет 4 центра связывания:

1.Для т-РНК.

2.Для АТФ.

3.Для аминокислоты.

4.Для воды (вода используется для гидролитического устранения неправильно присоединенных аминокислот).

Синтез аминоацил-т-РНК осуществляется в 2 этапа:

N

NH 2

OH

N

NH2

N

NH2

CH

N

N

C

O

P

O

N

N

N

(PO3H2)3

R O

O

O

CH

+ NH2

CH

COOH

2 O

CH

2

O

R

OH

OH

OH

OH

АТФ

Аминоациладенилат

т-РНК

NH 2				NH 2	Ц	А
			N	N	Ц	O
R CH
C	O	OH	N	N
					O	OH
O	P	O CH 2	O	+ т-РНК	C	O
	O
		OH	OH		R CH	NH 2

Аминоациладенилат Аминоацил-т-РНК

305

Инициация синтеза полипептидной цепи. Необходимые ком-

поненты:

1.и-РНК.

2.Инициирующая аминоацил-т-РНК (формилметионин-т-РНК у прокариот и метионин-т-РНК у эукариот).

3.Малая и большая субъединицы рибосом.

4.Факторы инициации IF1, IF2, IF3 5. Ионы Mg++ и ГТФ.

IF3	+	3		f-мет	f-мет
		30S	IF2	УАЦ	+ IF2
				УА
		30S		ГТФ	+ ГТФ
		Г
		IF2
		IF3	30S
			f-мет	инициаторный комплекс УАЦ

Стадия инициации начинается с объединения IF3 и малой субъединицы рибосом. IF3 необходима для опознавания на и-РНК иниции-

рующих кодонов (АУГ или ГУГ). В это же время инициирующая фор- милметионин-т-РНК связывается с IF2 и ГТФ. Оба комплекса объеди-

няются. Образуется инициаторный комплекс. Инициаторный комплекс связывается с и-РНК с помощью фактора IF1. IF2 способствует объе-

динению большой и малой субъединиц рибосом. Процесс протекает с затратой энергии ГТФ. После объединения обеих субъединиц высвобождаются все инициирующие факторы, ГДФ и неорганический фосфат. Описанный процесс необходим для определения точного места начала синтеза белка. Ошибка даже в 1 нуклеотид приведет к сдвигу рамки считывания и синтезу совершенно другого белка.

ГТФ
IF2
IF3 f-мет 30S
УАЦ
+ IF1	Р	А
+ и-РНК 5ÄАУГ УУУ ГАЦ ..3Ä	5Ä АУГ УУУ ГАЦ ... 3Ä		IF1
		IF2
	УАЦ	+ IF3
50 S		ГДФ
	f-мет	Н3РО4
В собранной рибосоме имеются 2 участка:
1. A-участок (аминоацильный) – имеет сродство к аминоацил-т-
РНК;
2. P-участок (пептидильный) – имеет сродство к пептидил-т-РНК.

306

Стадия инициации завершается присоединением в P-участке к кодону и-РНК формилметионин-т-РНК соответствующим антикодоном. В A-участке находится следующий кодон и-РНК, и он свободен для присоединения соответствующей аминоацил-т-РНК.

Элонгация полипептидной цепи. Необходимые компоненты:

1.Полный набор аминоацил-т-РНК.

2.Фермент пептидилтрансфераза.

3.Факторы элонгации EF-T, EFg.

4.Ионы Mg++ и ГТФ.

EF-T

EF-T

ДФ

Р

А

ГТФ

Р

О4

Р

А

5Ä

АУГ

УУУ

Г

5Ä

АУГ

У

ГА

5Ä

АУГ

У

УАЦ

ААА

УАЦ А

трансфераза

УАЦ ААА

EF-g

f-мет

фен

f-мет фен

Mg++

f-мет фен

ГТФ

EF-T

EF-g

Р

А

ГТФ

Р

А

ГДФ

5ÄАУГ

УУУ

ГАЦ

УЦЦ...3Ä

5Ä АУ

УУУ

ГАЦ

УЦ

ААА

ЦУ

ААА ЦУГ

f-мет

фен

асп

f-мет

фен

Элонгация начинается с присоединения аминоацил-т-РНК в A- участок рибосомы к комплементарному кодону и-РНК. Присоединение

происходит с затратой энергии ГТФ и при участии фактора ЕFT. В результате между кодоном и-РНК и антикодоном аминоацил-т-РНК об-

разуются водородные связи. Когда 2 аминокислоты оказываются рядом, фермент пептидилтрансфераза образует между этими аминокислотами пептидную связь. Пептидная связь образуется за счет макроэргической связи аминоацил-т-РНК. Образовавшийся дипептид силами гидрофобного взаимодействия связан с P-участком рибосомы, но, в то же время, он связан с т-РНК в A-участке. т-РНК присоединена водородными связями к кодону и-РНК. Дипептид не имеет сродства к A-

участку. При участии EFg фактора, с затратой энергии ГТФ происходит перемещение пептидил-т-РНК в P-участок. EFg обладает ГТФ- азной активностью, иными словами – является ГТФ-азой. В результате рибосома делает 1 шаг по и-РНК, и в A-участке появляется новый кодон и-РНК. Перемещение пептида из A-участка в P-участок называют транслокацией. К поступившему в A-участок кодону и-РНК вновь, по

307

принципу комплементарности присоединяется соответствующая ами- ноацил-т-РНК и процесс повторяется снова. Повторы происходят до тех пор, пока в A-участок не придет один из терминирующих кодонов.

Стадия терминации. Необходимые компоненты:

Особые цитоплазматические белки – факторы высвобождения

(FR1, FR2).

Указанные факторы опознают терминирующие кодоны (не кодирующие аминоацил-т-РНК, нонсенс-кодоны). FR1 – опознает УАА и

УАГ, FR2 – опознает УАА и УГА и связываются с ними. При этом они изменяют активность пептидилтрансферазы. Фермент приобретает пептидилэстеразную активность и присоединяет к пептидил-т-РНК не

аминокислоту, а воду. В результате полипептидная цепь отделяется от т-РНК. Рибосома диссоциирует на большую и малую субъединицы.

		Р	А		Р	А
5Ä	ГГЦ ЦГА ГЦЦ УАА 3Ä				5Ä ГЦЦ ЦГА ГЦЦ УАА 3Ä
	ЦГГ			FR1	ЦГГ
				FR2
		Ала		О	О
		С=О		f-метÃС ÃСНÃNHÃC à СНÃNHÃала
		НС-R		R	R
		NH
	полипе	ид-f-мет			50S	+
						30S

Фермент деформилаза (у прокариот) отщепляет формильную группу у N-концевого (инициаторного) формилметионина. Часто и у прокариот и у эукариот отщепляется N-концевой метионин от синте-

зированного пептида. В дальнейшем синтезированная полипептидная цепь спонтанно приобретает вторичную структуру, ферментативными путями – третичную и если белок олигомерен, то приобретает и четвертичную структуру.

Посттрансляционная модификация. На этой стадии происхо-

дит формирование белковой молекулы, пригодной для выполнения функции. Для этого может (не всегда) происходить химическая модификация белка: метилирование по аминогруппе лизина и аргинина, фосфорилирование по ОН-группе серина, окисление лизина, пролина,

присоединение кофактора, осуществляться частичный протеолиз.

308

3. Регуляция биосинтеза белков

Регуляции подвержены практически все этапы синтеза белков. Метаболиты и гормоны через ряд посредников способны изменять активность транскрипции; гормоны способны влиять на посттрансляционную модификацию белков через изменение активности ферментов метилаз и др., сами вновь синтезированные белки могут активировать разрушение своих и-РНК.

В1966 году впервые были идентифицированы и выделены бел- ки-репрессоры лактозного оперона (Lac-оперон). (Структура Lac- оперона была рассмотрена в предыдущей лекции). Открытие белков- репрессоров послужило толчком к изучению деятельности Lac-оперона

ипозволило Жакобу и Моно сформулировать концепцию регулируемого оперона.

Впроцессе регуляции участвуют 3 типа генов:

1)Ген оператор – связывается с белком репрессором и предотвращает транскрипцию.

2)Ген регулятор – кодирует структуру белка-репрессора и.

3)Структурные гены (кодируют -галактозидазу – фермент,

расщепляющий лактозу до глюкозы и галактозы, галактозидпермиазу – обеспечивает транспорт галактозидов из среды в клетку и тиогалакто- зил-ацетилтрансферазу).

В состав оперона входят:

1)Промотор (к нему присоединяется РНК-полимераза).

2)Ген-оператор.

3)Структурные гены.

4)Терминирующая последовательность.

Если клетки E.Coli растут на среде, содержащей лактозу, то в них синтезируется фермент -галактозидаза. Если в среде вместо лактозы находится глюкоза, -галактозидаза не синтезируется.

	р	Структурные гены
		атор		терминатор
ген-регулятор	Р	1	2	3
и-РНК		СЧИТЫВАНИЕ НЕ ПРОИСХОДИТ
			Lac-оперон	1. Ген -галактозидазы
трансля		К-полимераза		2. Ген галактозидпермиазы
				3. Ген тиогалактозид-
бел				ацетил-трансферазы
репресс
Появление в культуральной среде лактозы (индуктор) стимули-
рует синтез -галактозидазы по следующему механизму:

309

ген-регулятор
	Р		2	3	терминатор
и-РНК белка-		Синтез РНК			про-иРНК
репрессора		цАМФ			Процессинг
		CАР- +
		белок			и-РНК
Белок-репрес-	+				тезированные
сор	Лактоза	Конформация			белки
	белка-репрессора изменена		н	ато	ободен.

Индуктор (лактоза) связывается с белком-репрессором и образует прочный комплекс. Конформация белка-репрессора изменяется, и

он отделяется от гена оператора. Одновременно индуцируется образование комплекса цикло-АМФ-связывающего белка (САР-белок – сatabolite activator protein) и ц3’5’-АМФ. Образовавшийся комплекс

связывается с промотором и активирует транскрипцию ДНК ферментом РНК-полимеразой. Синтезированная РНК подвергается процессингу, и образуется 3 молекулы и-РНК, на основании которых синтезируются -галактозидаза, галактозидпермиаза и тиогалактозид-

ацетилтрансфераза. Индукция синтеза этих белков получила название

позитивной регуляции.

После переваривания лактозы комплекс белок-репрессор – лактоза разрушается. Конформация белка-репрессора меняется на исходную и он присоединяется к гену-оператору. Такая регуляция получила

название негативной.

В течение длительного времени оставалось неизвестным, можно ли применить эту модель контроля биосинтеза белка к клеткам эукариот. В настоящее время известно, что модель Жакоба и Моно лишь частично применима для эукариот. Регуляция биосинтеза белка в клетках эукариот значительно сложнее. Это обусловлено более сложной организацией ДНК эукариот. В эукариотических клетках ДНК упакована в нуклеосомы, регуляторные белки часто связываются с участками, удаленными от промоторов на значительные расстояния. У эукариот более обширны регуляторные зоны.

Г	егулятор Р	полимераза
		О	1	2	3	терминатор
и-РНК				Ген-оператор блокирован, синтез РНК не идет.
	-галакто-
	зидаза			елок-репрессор
	Лактоза разрушена		Конформация белка-репрессора восстановлена.
				310

Антибиотики Ã ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот и белков

Многие из наиболее эффективных антибиотиков, применяемых в современной медицине, действуют через ингибирование биосинтеза белка в бактериальной клетке. Знания особенностей структуры белоксинтезирующего аппарата у прокариот и эукариот позволили создавать высокоэффективные препараты, действующие преимущественно на метаболизм прокариот. Избирательность действия этих препаратов позволяет применять их в больших концентрациях без риска вызвать токсический эффект у человека.

Антибиотики, эффективные только в отношении прокариот:

1)Тетрациклин – предотвращает связывание аминоацил-т-РНК

сA-участком рибосомы. Прекращается элонгация белковой молекулы.

2)Неомицин и стрептомицин – связываются с 30S субъедини-

цей рибосом и изменяет ее конформацию. На стадии инициации нарушается сборка рибосомы на и-РНК.

3)Левомицетин (хлорамфеникол) – связывается с 50S субъединицей рибосом и ингибирует фермент пептидилтрансферазу. Не образуется пептидная связь между аминокислотами и прекращается удлинение полипептидной цепи.

4)Эритромицин и олеандомицин – блокируют реакцию транслокации пептидил-т-РНК в P-участок рибосомы.

5)Рифампицин – ингибирует стадию инициации транскрипции, связываясь с ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Прекращается синтез и-РНК. Препарат активен также и в отношении вирусов.

Антибиотики, эффективные в отношении прокариот и эукари-

от.

1)Пуромицин – связывается с пептидил-т-РНК и вызывает

преждевременное отделение полипептида от рибосомы.

2)Актиномицин Д – связывается с остатком дезоксигуанина в молекуле ДНК и блокирует перемещение РНК-полимеразы по молеку-

ле ДНК. Прекращается удлинение молекулы РНК.

Эффективны только в отношении эукариот.

1)Циклогексимид – прекращает реакцию транслокации на ри-

босомах.

2)Анизомицин – ингибирует пептидилтрансферазную реакцию на рибосомах.

И в заключении можно указать еще одно вещество, не относящееся к антибиотикам, однако, часто встречающееся в медицинской

практике – яд бледной поганки – -аманитин. Он избирательно ингибирует активность РНК-полимеразы II. В результате прекращается синтез и-РНК.

311