2 курс / Гистология / ВОЗМОЖНОСТИ_ЖИДКОЙ_БИОПСИИ_В_СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ_ПРОГНОЗА_ТЕЧЕНИЯ

91

При анализе по Спирмену показателей экспрессии генов в ЦОК и уровней lncRNA в сыворотке мы обнаружили следующие корреляции: PVT1 до ХТ и

ERCC1 в виментин+ ЦОК до ХТ (r=0,738, p=0,036); PVT1 до ХТ и VEGFA в

кадгерин+ ЦОК до ХТ (r=0,714, p=0,046; между этими показателями также присутствовала регрессионная взаимосвязь, р=0,037); MALAT1 до ХТ и ERCC1 в

виментин+ ЦОК во время ХТ (r=-0,578, p=0,009); HOTAIR до ХТ и VEGFA в

кадгерин+ ЦОК во время ХТ (r=-0,656, p=0,002); PVT1 до ХТ и CXCL2 в

кадгерин+ ЦОК во время ХТ (r=-0,964, p=0,0004); MALAT1 до ХТ и CXCL2 в

кадгерин+ ЦОК во время ХТ (r=0,519, р=0,022).

3.6. Цитокины сыворотки крови

Анализ крови на содержание IL-17Aи IL-18 до и во время ХТ выполнялся 72

пациенткам, характеристики которых представлены в таблице26.

Таблица 26. – Клинические характеристики пациенток, которым выполнялся анализ на цитокины крови

Клиническая характеристика		Число пациенток (абс. (%)
1. Возраст – медиана (IQRQ1-Q3), лет – 64 (55-68)
2. Уровень СА-125 при поступлении – медиана (IQR), Ед/мл – 355 (144-724)
3. Стадия FIGO
- I		7	(9,7%)
- II		1	(1,4%)
- III		43	(59,7%)
- IV		21	(29,2%)
4. Наличие асцита при первичной диагностике
Да		51	(75,0%)
Нет		21	(25,0%)
5. Гистологический подтип
Серозный		37	(51,4%)
Муцинозный		2	(2,7%)
Эндометриоидный		1	(1,4%)
Светлоклеточный		2	(2,7%)
Недифференцированный		5	(6,9%)
Не определялся из-за CRS 3		2	(2,7%)
Не получен гистоанализ (цитологическая		23	(31,9%)
верификация)
6. Режим химиотерапии
Неоадъювантная		51	(75,0%)
Адъювантная		21	(25,0%)

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

92

Клиническая характеристика			Число пациенток (абс. (%)
7. Циторедуктивная операция
Проводилась			40 (58,8%)
Не проводилась			32 (41,2%)
8. Поддерживающая терапия
Получали			9 (12,5%)
Не получали			63 (87,5%)
Изначальные уровни IL-17Aи IL-18	в крови пациенток значимо не

отличались от контрольных (р=0,116 и р=0,331 соответственно). Содержание IL-

17Aв крови пациенток с РЯ до лечения было ниже, чем у пациенток с доброкачественными опухолями яичников (р=0,012), а при доброкачественных

опухолях экспрессия IL-17А была повышена в сравнении с контролем (р=0,042)

(таблица 27).

Таблица 27. – Содержание IL-17Aи IL-18 в крови женщин контрольной группы, группы сравнения, пациенток с РЯ до лечения и пациенток с РЯ на фоне ХТ

		IL-17А				IL-18
	в кон-	в группе	при РЯ	при РЯ на	в конт-	в группе	при РЯ	при РЯ
	троле	сравнения	до ХТ	фоне ХТ	роле	сравнения	до ХТ	на фоне ХТ
Медиана,	41,48	63,54	38,36	43,67	299,90	255,77	348,77	299,40
пг/мл
Q1, пг/мл	39,58	51,23	29,53	32,39	161,69	214,24	192,27	210,92
Q3, пг/мл	47,13	70,13	54,69	62,87	376,77	319,03	451,08	389,52

В ходе лечения уровни IL-17А и IL-18 не изменились в сравнении с изначальными (р=0,134 и р=0,760 соответственно) в группе в целом,

носодержаниеIL-18 снижалосьсредиплатинорефрактерных пациенток (р=0,011). У

пациенток, получавшихадъювантную ХТ, в динамике повышался уровень IL-17А (р=0,017).

Уровни IL-17 и IL-18 до и во время лечения не отличались в зависимости от гистологического типа опухоли и стадии заболевания; содержание IL-18 до лечения у рефрактерных пациенток было выше, чем у остальных (р<0,001) (рис.17).

Присутствовала тенденция к повышению уровняIL-17 в ходе лечения среди пациенток с платиночувствительной опухолью по сравнению с нечувствительной

(р=0,054) (рис.18).

93

Рисунок 17. – Содержание IL-18в крови пациенток с клинически платинорефрактерным и не платинорефрактернымраком яичников

Рисунок 18. - Содержание IL-17Aв крови пациенток с клинически платиночувствительным и не платиночувствительнымраком яичников

Уровни IL-17, IL-18 в крови до ХТ не отличались в зависимости от наличия асцита при первичной диагностике (р=0,967, р=0,695). Содержание IL-17, IL-18 в

процессе ХТ в зависимости от наличия асцита (р=0,129 и р=0,877,

соответственно) и режима химиотерапии (НАХТ vsАХТ, p=0,341 и p=0,479,

соответственно) также не отличалось.

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

94

Среди пациенток, которым в ходе первой линии лечения была выполнена циторедуктивная операция, уровни IL-18 были ниже, чем у неоперированных пациенток, как до лечения (р=0,016), так и в процессе (р=0,052). Показатели IL-17

до и в ходе лечения в этих группах не различались.

Также обращало на себя внимание повышенное количество лейкоцитов в крови до лечения у пациенток с неплатиночувствительным заболеванием в сравнении с чувствительным (р=0,002), а также с наличием асцита в сравнении с его отсутствием (р=0,004). При этом между числом лейкоцитов и уровнем IL-18 в

крови до лечения присутствовала регрессионная взаимосвязь (R2=0,247, р<0,001).

Связь с СА-125, возрастом, числом тромбоцитов, ИМТ, СОЭ отсутствовала.

При построении модели биномиальной логистической регрессии для предсказания наличия рефрактерного заболевания из изученных показателей уровень IL-18 до лечения вносил малый, но значимый вклад (р=0,014, OR 1,004,

95% ДИ 1,001-1,008), снижая AICмодели, в уравнение в сочетании с фактором выполнения циторедуктивной операции (р=0,005, OR0,175, 95% ДИ 0,005-0,583;

характеристики модели: хи-квадрат 19,5, R20,233, специфичность 0,703,

чувствительность 0,720, точность 0,710, р<0,001) (рис.19).

Рисунок 19. – Вероятность платинорефрактерности РЯ в зависимости от выполнения циторедуктивной операции в первой линии лечения и уровня IL-18 в крови до начала терапии.

Как видно из таблицы 28, высокий уровень IL-18 до ХТ являлся неблагоприятным предиктором ВБП в однофакторном, но не многофакторном

95

анализе. При анализе ОВ наблюдался аналогичный результат: в однофакторном

анализе предиктивный потенциал присутствовал для IL-18 до ХТ (ОР 1,00, 95 %

ДИ 1,00-1,01, p=0,006) и во время ХТ (ОР 1,00, 95 % ДИ 1,00-1,01, p=0,008), но в

многофакторном анализе значимость терялась (p=0,183 и p=0,039

соответственно).

Таблица 28. – Результаты однофакторного и многофакторного регрессионного анализа для выживаемости без прогрессированияс учетом экспрессии IL-17A, IL18

Параметр	Анализ, ОР (95 % ДИ)
	Однофакторный		Многофакторный
	FIGO стадия
1-2	-		-
3-4	2,96 (0,92-9,54, p=0,069)		-
	FIGO M
0	-		-
1	6,45 (1,48-28,03, p=0,013)
	Асцит
Нет	-		-
Да	2,28 (1,14-4,57, p=0,020)		2,05 (0,99-4,28, p=0,055)
	Хирургическая операция
Да	0,22 (0,12-0,39, p<0,001)		0,18 (0,09-0,38, p<0,001)
Нет	-		-
	Гистотип
Серозный	0,79 (0,34-1,86, p=0,588)		-
Несерозный	-		-
	Химиотерапия
Адъювантная	-		-
Неоадъювантная	2,51 (1,26-4,99, p=0,009)		1,03 (0,42-2,51, p=0,951)
	Поддерживающая терапия
Да	0,20 (0,06-0,66, p=0,008)		0,09 (0,02-0,38, p=0,001)
Нет	-		-
Возраст	1,01 (0,98-1,04, p=0,580)		-
Уровень СА-125 до	1,00 (1,00-1,00, p=0,839)		-
лечения
IL-17A до ХТ	1,00 (0,99-1,01, p=0,826)		-
IL-18 до ХТ	1,00 (1,00-1,01, p=0,009)		1,00 (1,00-1,00, p=0,390)
IL-17A во время ХТ	1,00 (0,99-1,01, p=0,561)		-
IL-18 во время ХТ	1,00 (1,00-1,00, p=0,377)		-
В кластерном анализе методом k-средних			выделялись два кластера

пациентокна основании показателей IL-18 и числа лейкоцитов в крови до ХТ:

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

96

кластер 1 (IL-18 = 576,72пг/мл, количество лейкоцитов = 8,08*109/л) и кластер 2

(IL-18 = 274,17пг/мл, количество лейкоцитов = 6,72*109/л) (F=77,2, р<0,001 и

F=5.54, p=0,021 соответственно). При сравнении клинических характеристик между кластерами достоверно не различались доля выполнения операций,

неоадъювантной либо адъювантной ХТ, наличия асцита при первичной диагностике, распределение по стадиям, в то же время ВБП и ОВ в кластере 1 (с

высоким содержанием IL-18 и числом лейкоцитов) были ниже (логранговый критерий, р=0,012 и р=0,030 соответственно) (рис.20).

а

б

Рисунок 20. – Безрецидивная (а) и общая (б) выживаемостьв кластерах пациенток с высоким (1) и с низким (2) содержанием IL-18 и числом лейкоцитов в крови до лечения

97

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Механизмы развития и прогрессирования рака яичников во многом остаются неизученными, в связи с чем смертность от данного заболевания остается стабильно высокой в течение последних двух десятилетий. Применение таргетных препаратов позволяет существенно продлить выживаемость при РЯ, но таргетная терапия показана и доступна не всем пациенткам. Использование прогностических и предиктивных биомаркеров РЯ в реальной клинической практике ограничено определением уровня СА-125 и HE-4 в крови, а также мутационного статуса генов BRCA. Выявление новых биомаркеров РЯ может быть полезным как в клиническом, так и в фундаментальном смысле. Результаты трансляционных исследований биомаркеров помогают связать биологию канцерогенеза и прикладные вопросы уточнения прогноза болезни,

предоставляют потенциальные мишени для доклинических исследований,

выделяют группу пациенток, требующих наиболее пристального внимания в плане риска прогрессирования.

Среди методов исследования потенциальных биомаркеров рака яичников жидкая биопсия представлялась нам наиболее актуальной. Несмотря на бурное развитие области жидкой биопсии в онкологии в целом, литературные данные по РЯ крайне ограниченны. В то же время жидкая биопсия практически безболезненна и несет минимальные риски для здоровья пациентки, а изученные нами методы не относятся к таким высоко затратным, как, например,

высокопроизводительное секвенирование и многие другие методы, используемые

внастоящее время в рамках фундаментальных исследований.

Вданной работе мы ставили целью исследовать ряд маркеров, определение которых может быть транслировано в рутинную практику. Среди них количественные и качественные параметры циркулирующих опухолевых клеток,

свободно циркулирующие в крови длинные некодирующие РНК и цитокины.

Характеристики когорты пациенток в данном исследовании соответствовали характеристикам, наблюдаемым при раке яичников в целом и

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

98

описанным в литературе: средний возраст пациенток составил 57 (50,5-67,25) лет;

большинство женщин имели III и IV стадии заболевания (55,3 и 32,5%

соответственно); асцит при первичной диагностике присутствовал у 76,6%

участниц; абсолютному большинству участниц среди тех, кому выполняли патоморфологическое исследование, был выставлен диагноз high-grade серозной аденокарциномы (80,2 % без учета четырех пациенток с полным CRS и

невозможностью определить подтип); наследственный анамнез отмечали 13 %

пациенток. В данную работу не были включены данные о BRCA-статусе пациенток. Безусловно, отсутствие наследственного анамнеза не исключает наличие синдрома наследственного рака молочной железы и яичников.

Отсутствие данных о BRCA-статусе является ограничением данного исследования, но стоит отметить, что результат стандартного ПЦР-анализа распространенных мутаций далеко не всегда точен, а секвенирование генов BRCA

обладало низкой доступностью на момент проведения исследования; кроме того,

участницы получали одинаковую схему химиотерапии и не получали таргетные препараты, назначение которых определяется BRCA-статусом.

Среди клинических признаков в нашей когорте предикторами длительности ВБП были возраст и факт выполнения циторедуктивной операции, что согласуется с данными литературы, свидетельствующими о крайней важности циторедуктивного вмешательства для пациенток с раком яичников. Важная роль выполнения операции сохранялась во всех подгруппах и также была статистически значима в отношении длительности ОВ. Кроме того, предиктором общей выживаемости была клиническая платиночувствительность первого рецидива, что также согласуется с современными представлениями, поскольку неплатиновые цитостатики гораздо менее эффективны при данном заболевании.

Следует отметить, что в многофакторном анализе с участием только прооперированных пациенток (73 пациентки, 63,7% от общей когорты)

адъювантная химиотерапия была связана с выигрышем в ОВ в сравнении с неоадъювантной. Сравнительная эффективность НАХТ и АХТ при раке яичников остается предметом споров среди врачей-исследователей. Во многом это связано

99

с отсутствием общепринятых показаний к НАХТ, сложностью оценки распространенности перитонеальногоканцероматоза до операции [231].

В двух из четырех подгрупп пациенток регрессионная связь между применением бевацизумаба и длительностью ВБП ожидаемо достигала статистической значимости, однако в целом доля участниц, получавших поддерживающую терапию бевацизумабом, была невелика (12,3%), что, скорее всего, является причиной отсутствия аналогичного результата в общей когорте.

Исследования показали, что при всех использованных нами методиках показатели биомаркеров в крови до лечения и во время лечения значимо не изменялись: это касается и числа различных ЦОК, и экспрессии маркеров в ЦОК,

и циркулирующих длинных некодирующих РНК (lncRNA), и цитокинов.

Единственным исключением было снижение содержания IL-18 в крови платинорефрактерных пациенток (р=0,011). На основании этого можно предполагать, что либо однократный забор крови достаточно информативен, либо для анализа в динамике следует использовать другую временную точку,

например, по завершении всех курсов первой линии лечения.

Ни один из изученных маркеров не коррелировал с уровнем СА-125:

очевидно, данные маркеры не имеют связи с распространенностью заболевания,

каковая наблюдается для СА-125. Это подтверждается и отсутствием связей с клинической стадией болезни, за исключением повышенного содержания

HOTAIR до ХТ при наличии отдаленных метастазов в сравнении с их отсутствием

(р=0,022).

Несмотря на статистически схожие численные значения всех изучаемых показателей, результаты корреляционного и факторного анализов до и во время лечения были различными. В первой подгруппе исследования оценивались численность ЦОК, определяемых согласно маркерам клеточной поверхности как эпителиальные, мезенхимальные, бифенотипичные и различные варианты стволовых. До лечения количества клеток эпителиального и мезенхимального фенотипов коррелировали между собой (EpCAM+CK+ и EpCAM-vim+ (r=0,427, p=0,021), EpCAM+CK+ и vim+ (r=0,436, p=0,018)), а содержание мезенхимальных

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

100

клеток коррелировало с содержанием некоторых из стволовых фенотипов (CKvim+ и CD133+ALDHhigh (r=0,505, p=0,027) и EpCAM-vim+ и ALDHhigh (r=0,597, p=0,004)). Во время лечения все эти корреляции не наблюдались. Более того, до лечения число клеток, экспрессирующих все три стволовых маркера

(CD44+CD133+ALDHhigh), возрастало с ростом числа эпителиальных ЦОК

(EpCAM+CK+, R2=0,315, p=0,002), а во время лечения между показателями

EpCAM+CK+ и CD44+CD133+ наблюдалась отрицательная корреляция (r=−0,584, p=0,011). Наглядно различия во взаимоотношениях переменных можно увидеть на рис. 21, демонстрирующем результаты анализа главных компонент с указанными показателями.

Рисунок 21. – Результаты анализа методом главных компонент с учетом показателей числа ЦОК эпителиального, мезенхимального, стволового фенотипа в образцах до ХТ (слева) и во время ХТ (справа)

В одном из исследований [227] авторы использовали комплексный подход для выявления EpCAM-положительных ЦОК рака яичников, который включал параллельный анализ с помощью ПЦР и иммунофлуоресцентного (ИФ)

окрашивания в образцах крови, полученных до и после первичного лечения (через

6 месяцев после окончанияадъювантной терапии). Количество ЦОК до и после лечения не отличалось, однако в образцах до лечения присутствовала конкордантность результатов, полученных двумя методами, а после лечения