2 курс / Гистология / ВОЗМОЖНОСТИ_ЖИДКОЙ_БИОПСИИ_В_СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ_ПРОГНОЗА_ТЕЧЕНИЯ

21

в менее дифференцированном, более или менее эпителиальном, статусе, и

получает преимущества обоих конечных фенотипов одновременно. Подобную

«флюктуацию» фенотипа называют эпителиально-мезенхимальной (ЭМ)

пластичностью [95]. Все больше авторов обращают внимание на промежуточные фенотипы, сообщая о крайне туморогенном поведении подобных клеток [76].

Связь между фенотипическим состоянием клетки и ее преимущественной активностью описана гипотезой «goorgrow» («идти или расти»). Гипотеза состоит в том, что эпителиальная (или «более» эпителиальная) клетка сконцетрирована на пролиферации, тогда как мезенхимальная меньше пролиферирует и больше перемещается [193]. «Решение» о том, какую активность предпочесть, также координируется состоянием внешней микросреды – если возможности для численного роста клона ограничены, например, имеется недостаток кислорода или пространства в нише, то клетка может склоняться к миграции [105].

Применимость данной гипотезы к РЯ показана в исследовании ксенографтов,

полученных из опухолевой ткани пациенток: клетки более эпителиальных образцов демонстрировали активное самообновление, а более мезенхимальных -

миграцию и инвазию; при этом во всех образцах были обнаружены клетки гибридного фенотипа [42].

Теоретически, серия переключений между «идти» и «расти» является идеальной стратегией для ЦОК. Изначально эпителиальная опухолевая клетка запускает ЭМП и активирует мезенхимальные свойства, обеспечивая локальную инвазию, миграцию в направлении сосуда, интравазацию и поступление в системный кровоток, где мы можем обнаружить ее как ЦОК. Мезенхимально-

подобные опухолевые клетки по одиночке и в мелких кластерах обнаружены в инвазивном крае ряда эпителиальных ЗНО – феномен «почкования» опухоли

(tumorbudding). Клетки «почек», в отличие от основной паренхимы опухоли,

низко или совершенно не экспрессируют Е-кадгерин и другие эпителиальные молекулы адгезии, но высоко экспрессируют ЭМП-ассоциированные факторы транскрипции и главный триггер ЭМП TGF-β [66]. При таком активном поведении шанс клетки попасть в циркуляцию в жизнеспособном состоянии

22

намного больше, чем при ее пассивном отщеплении с ростом первичной опухоли.

По окончании этапа циркуляции клетка экстравазируется в орган-мишень и должна адаптироваться в нем, чтобы избежать апоптоза, постигающего большинство ЦОК. Здесь запускается МЭП, возникает пролиферативный потенциал, прогрессия клеточного цикла, формируется новый опухолевый очаг

[185].

Фактически, однако, еще неизвестно, все ли ЦОК подвергаются ЭМП и МЭП, когда именно запускаются эти процессы и какие факторы в наибольшей степени определяют их. Внутри одного опухолевого очага могут находиться будущие ЦОК на различных этапах своей диссеминации и с различным ЭМ-

фенотипом. Например, более эпителиальные клетки могут покидать первичный очаг после разрушения внеклеточного матрикса более мезенхимальными клетками [78]. При коллективной миграции в составе кластеров также могут присутствовать фенотипически отличные ЦОК (рис. 2).

Более того, клетка может начать ЭМП во время своего путешествия по циркуляторному руслу. Sun Y.F., Guo W., Xu Y. и др. (2018) сравнили ЭМ-

состояние (экспрессия цитокератинов, виментина, показатели иммунофлюоресцентной микроскопии) опухолевых клеток, полученных из разных кровеносных сосудов, у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой.

Оказалось, что ближе к первичному очагу доля эпителиальных клеток среди ощего числа была больше. Возможно, триггерами ЭМП внутри сосудаслужат изменения концентраций биологически активных молекул во внешней среде и стресс, так как мезенхимальной клетке легче избежать аноикиса и/или уйти в дормантное состояние.

Возвращаясь к проблеме выделения гетерогенных ЦОК из крови, нужно отметить, что иммуно-опосредованные методики с детекцией поверхностных маркеров применяются в исследованиях чаще других. При этом до последних лет большинство из них оценивали только эпителиальные маркеры, не учитывая присутствие мезенхимальных и близких к ним клеток. До сих пор лишь один способ подсчета одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством

23

пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США - методика CellSearch для

уточнения прогноза рака молочной железы.

Рисунок 2. - Различные фенотипы циркулирующих опухолевых клеток и их возможный вклад в прогрессии опухоли.Опухолевые клетки способны циркулировать поодиночке либо в кластерах. Как единичная клетка, так и клетка в составе кластера может быть эпителиального, мезенхимального или гибридного фенотипа. Кластеры могут содержать различное количество клеток, а также включать в себя неопухолевые клетки, например нейтрофилы. Процесс формирования гетеротипичных кластеров малоизучен, однако известно, что взаимодействие опухолевых и неопухолевых клеток повышает злокачественный потенциал кластера. Открытым также остается вопрос о степени пластичности фенотипа ЦОК и длительности пребывания клетки в различных фенотипических состояниях.

Применяемые в ней антитела комбинируют негативную селекцию при помощи анти-CD45 (отсев лейкоцитов) и позитивную селекцию при помощи антител к EpCAM, цитокератинам 8, 18 и/или 19 [57]. Все эти маркеры свойственны только эпителиальным ЦОК и тем гибридным фенотипам, которые близки к эпителиальному. Подсчет ЦОК с помощью CellSearch при раке яичников дает противоречивые результаты. Povedaetal. оценивали количество ЦОК при рецидивном РЯ до начала лечения среди 216 пациенток. Количество ЦОК ≥2

было значимо ассоциировано с увеличением риска прогрессирования и смерти в

24

унивариантном анализе, но в мультивариантном с учетом известных прогностических факторов – платиночувствительности, уровня СА-125, числа и размера очагов, дифференцировки опухоли и общего статуса по ECOG -

значимость оказалась пограничной [45]. В другом исследовании, включавшем пациенток с прогрессирующим и рецидивным РЯ, связь между наличием ЦОК и прогнозом болезни отсутствовала [166]. Возможности СellSearch при первичном РЯ исследовали Banys-Paluchowski M., Fehm T., Neubauer H. и др. (2020). Авторы проводили анализ в динамике трижды: до начала лечения, после 3 и после 6

курсов химиотерапии первой линии. Когорта включала пациенток с первичным и рецидивным заболеванием; в целом, среди ЦОК-положительных до лечения и после 3 курсов пациенток общая выживаемость была ниже, чем у ЦОК-

отрицательных, но при подгрупповом анализе среди первичного РЯ ассоциация не подтвердилась. Известно, что с помощью мезенхимальных либо комбинации Э/М поверхностных маркеров можно обнаружить большее число ЦОК рака яичников, чем с помощью только эпителиальных. К такому выводу пришли Po J.W., Roohullah A., Lynch D. и др. (2018) выделив ЦОК из крови 18 пациенток иммуномагнитным методом – используя антитела к эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM) и мезенхимальномуN-кадгерину. Однако авторы отмечают наличиеN-кадгерин-позитивных клеток в крови и у доноров из контрольной группы, подчеркивая высокую вероятность получения ложноположительных результатов. Исследование не имело целью оценку корреляций с клиническими параметрами, и в данной статье нет данных о выживаемости пациенток в зависимости от числа мезенхимальных ЦОК. Подобные данные получены в отношении другого поверхностного мезенхимального маркера – виментина. Gao Y., Fan W.H., Song Z. и др. (2021) оценивали присутствие ЦОК в крови пациентов

сразличными злокачественными опухолями и здоровых людей.

МезенхимальныеЦОК (определенные как CD45-DAPI+виментин+) выявляли гораздо чаще, чем эпителиальные (EpCAM+). Подчеркивается, что источником виментина в крови могут служить разрушенные лейкоциты, поскольку этот белок является компонентом их цитоскелета. Авторы предлагают использовать анализ

25

единичных клеток как способ решения проблемы, но данный метод достаточно трудоемок и финансово токсичен.

Экстраполируя закономерности опухолевой эволюции в ткани РЯ на циркулирующие опухолевые клетки, можно предположить, что ЦОК различных фенотипов могут вносить больший или меньший вклад в клиническое течение заболевания. Системное лекарственное лечение ЗНО проводится с целью уничтожения, в том числе, ЦОК (особенно это касается адъювантной химиотерапии). В ряде случаев химиотерапия становится определяющим фактором селекции в опухоли, оставляя жизнеспособными те клетки, которые наиболее эффективно удаляют препарат путем эффлюкса, скрываются от его воздействия в состоянии аутофагии, или используют другие известные механизмы химиорезистентности. Известно, что ЭМП в клетках опухоли ассоциирован с клиническим течением РЯ и ответом на лечение. Так, в работе

Quattrocchi L., Green A.R., Martin S. и др. (2011) показана положительная корреляция ОВ с экспрессией эпителиального Е-кадгерина и отрицательная – с

экспрессией мезенхимальногоN-кадгерина в опухолевой ткани. Преобладание мезенхимального фенотипа в клетках перитонеальных и плевральных смывов пациенток с РЯ поздних стадий является предиктором низкой ОВ [201]; в

эксперименте на мышиных моделях экспрессия Snail была положительно ассоциирована с распространенностью заболевания, а ее подавление вызывало уменьшение размеров опухолевых очагов [199]. Эпителиально-мезенхимальный переход часто приводит к фенотипу множественной лекарственной устойчивости и радиоустойчивости [93]. В платинорезистентных клетках РЯ в сравнении с платиночувствительнымигиперэкспрессируются ЭМП-ассоциированные факторы snail, slug, twist2, zeb2, а также виментин [75].

Как и клетки первичной опухоли, не все представители ЦОК в равной степени чувствительны к терапии. Например, при раке молочной железы неоадъювантное лечение повышает число ЦОК с признаками ЭМП [98], и именно такие клетки могут в дальнейшем ухудшать прогноз заболевания [46]. Что касается РЯ, если рецидив или прогрессирование болезни развивается из не-

26

химиочувствительного клона, то узнать об этом на настоящий момент мы можем лишь эмпирически, когда терапия не оказала эффекта. Спектр лечебных опций в этой ситуации крайне ограничен; он мог бы быть расширен при понимании того,

какой именно фенотип клеток персистирует несмотря на терапевтическое воздействие. В недавно опубликованном отчете Yang J. Ma J., Jin Y. и др. (2021)

разработали прогностическую номограмму на основании данных пациенток РЯ из свого центра с учетом клинических факторов (стадия по FIGO, степень дифференцировки, наличие асцита, вовлечение лимфатических узлов и уровень СА-125) и присутствия ЦОК до лечения. На основании этих показателей можно было выделить три группы риска развития рецидива в течение следующего года или двух. Наилучший показатель AUC был достигнут при учете как общего числа ЦОК, так и доли из них мезенхимальных ЦОК.

Ранее несколько групп ученых публиковали данные о результатах молекулярного профилирования ЦОК при РЯ на фоне химиотерапии. В сравнении с клетками из образцов, полученных до лечения, после ХТ первой линии больше ЦОК экспрессировали EpCAM в когорте исследования Aktas B., Kasimir-Bauer S., Heubner M. и др. (2011), хотя авторы не ставили целью оценить экспрессию конкретных маркеров в связи с выживаемостью и ответом на лечение и не разделяли ЦОК на эпителиальные и мезенхимальные. В более позднем исследовании с применением иммуномагнитной сепарации ЦОК экспрессия

EpCAM при первичной диагностике была ассоциирована с резистентностью к химиотерапии и низкой ОВ [20]. При этом ЦОК обнаружились у 90% пациенток в когорте, хотя треть из них имели I-IIстадии заболевания. Остальные оцениваемые маркеры – MUC1, WT1, P16, PAX8 – не продемонстрировали связей с прогнозом.

Примерно в то же время были опубликованы данные Chebouti I.,Kasimir-Bauer S., Buderath P. и др. (2017), которые продемонстрировали, что после ХТ первой линии при раке яичников возрастает доля мезенхимальных ЦОК с 30,0 до 52,0%,

при этом большое число эпителиальных ЦОК после химиотерапии связано с низкой ВБП и ОВ, а большое число мезенхимальных ЦОК после химиотерапии – только с низкой ОВ. Работ в этом направлении не так много, и на настоящий

27

момент нет однозначного ответа на вопрос, экспрессия каких именно генов в ЦОК

рака яичников имеет клиническое значение.

1.4. Роль стволовых свойств в судьбе циркулирующей опухолевой

клетки

Представления о патогенезе приобретенной химиорезистентности опухолей тесно связаны с гипотезами эволюции злокачественных клеток. С 1976г.

общепринятой являлась модель клональной эволюции. Она предполагает, что внутриопухолевая гетерогенность возникает из-за нестабильности генома клеток и накопления мутаций [155]. При этом эволюция происходит не линейно.

Одновременно в опухоли сосуществуют различные клоны, среди которых в динамике канцерогенеза постоянно происходит дарвиновская селекция наиболее жизнеспособных, или наиболее агрессивных – в том числе, резистентных к воздействию цитостатиков. Драйверные мутации, возникшие на ранних этапах формирования опухоли, присущи каждому из этих клонов; в остальном клоны могут отличаться друг от друга как генотипически, так и фенотипически. С

повышением мутационной нагрузки мутации-«пассажиры» способны приобретать независимую значимость.

Позднее стало ясно, что параллельно с возникновением мутаций и генетической селекцией происходит и адаптация клеток на эпигенетическом уровне. Совместно эти два процесса приводят к значительному разнообразию фенотипов опухолевых клеток в организме пациента [31]. Движущей силой процессов селекции и адаптации являются сложные взаимодействия злокачественных клеток с микроокружением [144, 232].

В последнее десятилетие приобрела популярность гипотеза стволовых опухолевых клеток (СОК, или CSC – cancerstemcells, также называемые опухоль-

инициирующими клетками - tumor-initiatingcells) [49]. Согласно последней,

гетерогенность опухолевого очага имеет сходства с иерархией дифференцировки в нормальной ткани: существует дискретная субпопуляция стволовых клеток,

28

способных инициировать и поддерживать опухолевый рост. Присутствие СОК не исключает наличия клональной эволюции, однако, в отличие от классической модели, основным субстратом эволюции в данном случае считается стволовой пул, так как именно его представители способны «зафиксировать» адаптационное изменение в клоне [24]. Каждый существующий и размножающийся субклон опухоли содержит свой компартмент СОК.

Предположения о существовании СОК в различных опухолях, в том числе РЯ, были высказаны еще в 1977 г. [32] при остром миелолейкозе. При сортировке лейкемических клеток на субпопуляции авторы обнаружили, что одна из них отличается от остальных высокой туморогенностью и способностью к самообновлению.

Впоследствии СОК обнаружили в солидных опухолях [174, 175], и были выявлены другие их характеристики. В частности, мультилинейная дифференцировка позволяет СОК полностью воспроизводить гистологическую структуру первичной опухоли при перевивании, в том числе давать начало опухолевым кровеносным сосудам за счет феномена васкулогенной мимикрии

[207]. Более того, СОК низкодифференцированной серозной аденокарциномы яичника способны давать начало и лимфатическим сосудистым структурам [34].

Способность к ассиметричному митотическому делению позволяет поддерживать постоянную численность стволового пула [213]. При этом одна из дочерних клеток дает начало более дифференцированным элементам клона, а вторая остается идентичной материнской СОК. Интенсивность и симметричность деления может меняться в зависимости от условий микроокружения –«ниши»,

которая играет ключевую роль в регуляции жизнедеятельности СОК, аналогично нише нормальных стволовых клеток.

Основными отличиями СОК от нормальных клеток являются нестабильность генома и выраженная фенотипическая пластичность [191],

особенно в солидных опухолях, отличающихся высоким генетическим разнообразием [30]. В функциональной идентификации СОК используется их способность формировать 3D колонии, растущие без подложки (сфероиды). Оно

29

связано с повышенной резистентностью к аноикису (гибели клетки в результате потери межклеточных контактов) в сравнении с более дифференцированными опухолевыми клетками, что создает предпосылки к изучению СОК в жидких средах организма [205].

Предшественниками СОК могут служить как нормальные стволовые клетки данной ткани [74], так и злокачественные клетки в процессе дедифференцировки

[106], если вокруг них создана подходящая "ниша". Считается, что в яичнике благоприятная ниша располагается в области ворот, так как эпителиальные клетки в этом участке отличаются медленным клеточным циклом и экспрессией поверхностных стволовых маркеров. После инактивации генов-супрессоров опухолей ТР53 и Rb1 они приобретают крайне высокую туморогенность и формируют сфероидные колонии [161]. Другими авторами показано, что при экспериментальном нарушении функции р53 и трансфекции онкогенов c-Myc и K-Ras нормальные стволовые клетки яичника моделируют гистологическую структуру РЯ [235]. Существуют положительные корреляции экспрессии в ткани РЯ мутантного р53 с экспрессией SOX2 и Notch1известных «стволовых» генов,

регулирующих самообновление клетки [27]. В целом, процесс приобретения более дифференцированной опухолевой клеткой стволовых свойств во многом перекликается с процессами эпителиально-мезенхимального перехода. При этом промежуточный ЭМ-фенотип наиболее часто связан с проявлениями стволовых характеристик клеток РЯ.При дифференцировке как в эпителиальную, так и в мезенхимальную сторону стволовые свойства могут утрачиваться [21,39].

Благоприятная среда для СОК при РЯ создается и в асцитической жидкости.

Рак яичников уникален в частоте развития имплантационных метастазов, и эта особенность согласуется с наблюдениями о большом числе СОК в асците [69, 208]. СОК активно вырабатывают молекулы адгезии PECAM1 и ICAM1 для прикрепления к мезотелию брюшины [37]. После прикрепления они взаимодействуют с мезотелием, индуцируя в последнем секрецию матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) - фермента, разрушающего межклеточный маткрикс для облегчения инвазии СОК [81]. В свою очередь, асцитическая

30

жидкость влияет на СОК посредством содержащихся в ней цитокинов,

активирующих проканцерогенный сигнальный путь NFkappaB [29]; липидов,

служащих источником энергии [13]; лейкоцитов, поддерживающих жизнедеятельность сфероидных колоний [158, 238].

Роль сигналингаWnt/β-катенин в канцерогенезе РЯ хорошо известна [241, 160], и все больше работ демонстрируют его высокую активность в СОК и участие в развитии химиорезистентности [59]. В стволовых клетках РЯ активен также путь PI3K/Akt/mTOR, объединяющий процессы эпителиально-

мезенхимального перехода (ЭМП) и приобретения «стволовости» [115]. Третий ключевой сигналинг для стволовых клеток РЯ - путь NF-κB. Его классическая активация приводит к пролиферации и экспансии членов сфероидной колонии,

тогда как альтернативный путь - к их самообновлениию и химиорезистентности

[152]. Доклинические данные демонстрируют потенциальную эффективность нестандартных для лечения РЯ химиопрепаратов (ингибиторов полимеризации микротрубочек) при стволово-подобном подтипе опухоли согласно молекулярно-

генетической классификации [88]; в настоящее время проводится клиническое исследование данной гипотезы.

Логично предположить, что ЦОК со стволовыми свойствами имеют преимущество перед более дифференцированными ЦОК, ведь стволовые клетки обладают наибольшей ЭМ-пластичностью, резистентностью к аноикису,

способностью переходить в дормантное состояние и туморогенностью.

Существуют различные группы методов выделения СОК среди других клеток опухоли. В настоящее время ни один из них не способен однозначно предсказать судьбу клетки. Первые исследования о СОК применяли метод сортировки по поверхностным антигенам, и до сих пор различные варианты сортировки используются чаще других методик. Различные опухоли имеют несколько отличающийся фенотипический портрет СОК; большинством авторов считается, что стволовые клетки РЯ экспрессируют такие маркеры, как CD133

(проминин), ALDH (альдегиддегидрогеназа), CD44 (гиалуронан), CD117 (c-kit), MyD88 (белокпервичногоответамиелоидной дифференцировки), CD24