2 курс / Гистология / ВОЗМОЖНОСТИ_ЖИДКОЙ_БИОПСИИ_В_СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ_ПРОГНОЗА_ТЕЧЕНИЯ

51

Таблица 2. - Антитела, использованные в исследовании методом проточной цитометрии

№	Производитель	Наименование	Использование
1	BioLegend	PE anti-human CD45 Antibody Clone	CD45
		2D1
2	BioLegend	PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC)	Изотип
		Antibody clone MOPC-21
3	BioLegend	APC anti-human CD44 Antibody Clone	CD44
		BJ18
4	BioLegend	APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl	Изотип
		Antibody clone MOPC-21
5	Miltenyibiotec	CD133/1 VioBright 667 mouse IgG1	CD133
		clone AC133
6	Miltenyibiotec	VioBright 515 mouse IgG1, Clone IS5-	Изотип
		21F5
7	Stemcell	ALDEFLUOR kit #01700	ALDH
8	BioLegend	FITC anti-human CD45 Antibody clone	CD45
		HI30, Mouse IgG1, к
9	BioLegend	FITC Mouse IgG1, κ Isotype Antibody,	Изотип
		Clone MOPC-21
10	Invitrogen	CD326 (EpCAM) Monoclonal Antibody	EpCAM
		PE-Cyanine7 clone 1B7
11	Invitrogen	PE-Cyanine7 mouse / IgG1, kappa	Изотип
		clone P3.6.2.8.1
12	Abcam	Mouse Anti-Cytokeratin 8 + 18 + 19	Первичные
		antibody clone 2A4 (ab41825) IgG1
13	BioLegend	Brilliant Violet 421™ anti-mouse IgG1	Вторичные
		Antibody clone RMG1-1
14	BioLegend	Alexa Fluor 647 anti-Vimentin Antibody	Vimentin
		clone 091D3 Mouse IgG2a
15	BioLegend	Alexa Fluor 647 anti-mouse IgG2a clone	Изотип
		RMG2a-62

2.3 Определение экспрессии генов в циркулирующих опухолевых

клетках

2.3.1. Выделение ЦОК из крови с использованием магнитных частиц

На	основе	подхода	коммерческого	набора	OvarianCancer
Select/DetectAdnaTest			(Qiagen,		Germany)

(https://www.qiagen.com/it/products/discovery-and-translational-research/exosomes-

ctcs/circulating-tumor-cells/adnatest-ovarian-cancer-ce/) а также существующей

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

52

патентованной методики выделения ЦОК из крови пациенток с РМЖ

[4]модифицирована методика выделения ЦОК из венозной крови для пациенток с РЯ.

Исследование проводили не позднее 2 часов после взятия крови. В

пробирку с 4 мл ЭДТА-стабилизированной крови добавляли 20 мкл магнитных частиц, конъюгированных с антителами, предварительно трехкратно промытых фосфатно-солевым буфером (PBS, рН=7.4) для удаления азида натрия.

Для выделения двух субпопуляций ЦОК различного фенотипа были использованы следующие антитела:

-субпопуляция I была обогащена клетками, экспрессирующими на поверхности EpCAM, CK18, Vimentin;

-субпопуляция II была обогащена клетками, экспрессирующими на поверхности EpCAM, CK18, E-cadgerin (таблица 4).

Таблица 4. - Антитела, использованные при выделении ЦОК из крови для дальнейшего молекулярно-гентического анализа

Наименование				Каталожный	Концентрация	Производитель
				номер
Polyclonal antibody to E-				PAA017Hu01	0.34 mg/ml	Cloud-Clone
cadherin						Corp., USA
Polyclonal	antibody		to	PAB231Hu01	1 mg/ml
Cytokeratin 18 (CK18)
Polyclonal	antibody		to	PAB283Hu01	0.49 mg/ml
Epithelial	Cell	Adhesion
Molecule (EPCAM)
Polyclonal	antibody		to	PAB040Hu01	0.48 mg/ml
Vimentin (VIM)

Иммобилизация антител в конечной концентрации 500 мкг/мл происходила с использованием набора магнитных частиц с G-белком производства Sileks (Москва, Россия).

1. Вносили в 2 мл пробирку 50 мкл дистиллированной воды, 240 мкл 0.1М

фосфатного буфера, 500 мклглутарового альдегида 50,0%, 200 мкл магнитных частиц 50 мг/мл, и инкубировали 3 часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

53

2.Используя магнитный штатив, удаляли супернатант и промывали частицытрехкратно фосфатным буфером 0.025 М.

3.Суспензию обработанных глутаровым альдегидом магнитных частиц переносили в пробирку с белками, иммобилизованными в буфере для иммобилизации. Инкубировали 2 часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

4.Удалив супернатант, добавляли терминирующий буфер и инкубировали 2

часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

5.Промывали частицы четырехкратно фосфатным буфером.

6.Суспендировали частицы в PBS с добавлением 1,0% азида натрия.

Далее производили выделение ЦОК из крови с использованием МЧ согласно следующему протоколу:

1. Переносили по 4 мл крови в 15 мл стерильные пробирки, добавляли по

22 мкл хорошо суспензированных МЧ в каждую пробирку. Помещали на шейкер на 45 мин при медленном перемешивании (5 rpm) при комнатной температуре.

2.Помещали пробирки в большой магнитный штатив на 3 минуты для отделения МЧ с абсорбированными клетками от остального объема крови.

3.Для дальнейшей работы с МЧ использовали набор SileksMagNA-Direct

(KIRCNA2000) (ООО Силекс, Москва). Добавляли буфер Lysis&Binding по 1000

мкл в каждую пробирку, перемешивали, оставляли на 10-15 минут при комнатной

температуре.

4.Помещали в магнитный штатив на 1 мин, удаляли супернатант.

5.Переносили в 1,5 мл пробирку суспензию. Промывали буфером Wash 200

мкл однократно, далее помещали в магнитный штатив.

6.Промывали двухкратно 500 мкл дистиллированной водой.

7.Добавляли 36 мкл буфера Elution, прогревали 5 мин при 80°C.

Отобиралисупернатант в отдельную пробирку, добавляя дополнительно 1 мкл буфера Fixation для сохранения РНК.

Для предотвращения деградации РНК образцы сразу пускали в реакцию обратной транскрипции в объеме 9 мкл.

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

54

Протокол ОТ и ПЦР был аналогичен описанному при анализе lncRNA (см.

2.4).

В качестве генов-рефери (house-keeping) использовали гены 18S и GAPDH,

меченные Fam (TaqMan® GeneExpressionAssay 18S (Hs99999901_s1), GAPDH

(Hs03929097_g1)).

Были использованы следующие коммерческие наборы производства Thermo

Scientific: 4331182_Hs99999901_s1 18S, 4331182_Hs00900055_m1 VEGFA,

4331182_Hs00157415_m1 ERCC1, 4331182_Hs99999918_m1 TGFB1,

4331182_Hs00601975_m1 CXCL2.

2.4 Определение экспрессии длинных некодирующих РНК, свободно

циркулирующих в крови

От участниц исследования забирали по 5 мл венозной крови в пробирку

BDVacutainer, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).

Образцы крови центрифугировали в течение 1 часа после сбора при 600g в

течение 20 минут при комнатной температуре, затем супернатант переносили в новые микроцентрифужные пробирки и повторно центрифугировали при 6000g в

течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить удаление всего клеточного дебриса. Образцы плазмы хранили при -80°C до этапа выделения.

Выделение свободно циркулирующих нуклеиновых кислот (НК) проводили с использованием коммерческого набора KIRCN2000 с использованием магнитных частицSileksMagNA-Direct (ООО"Sileks”, г.Москва, Россия), обеспечивающих избирательное связывание НК в одноили двухцепочечной форме. Процедура выделения из 2 мл плазмы крови включала первоначальный лизис и денатурацию для освобождения НК от комплексов с белками и другими компонентами с использованием лизирующего буфера при комнатной температуре в течение 20

минут. Далее к каждому образцу добавляли 5 мклсуспензированных магнитных частиц (МЧ) SileksMagNA-Direct с последующей инкубацией в течение 10 минут при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Для сбора МЧ и

4-х-кратной промывки образца использовали магнитный штатив. Элюция

55

выделенных НК проводилась с использованием специального буфера

ElutionSileksMagNA-Direct после инкубации при 80°C в течение 5 минут. Сразу же после выделения проводили постановку реакции обратной транскрипции из-за возможной деградации растворенной РНК при хранении. Для получения кДНК на матрице РНК в I часть реакции ОТ предварительно прогревали при 70°С в течение 3 минут смесь из 9 мкл образца, 1 мкл случайного гексануклеотидного

(random-primer) праймера и 2 мклRNAase-freewater (стерильной воды), далее добавляли 2 часть реакционной смеси, включающей буфера для обратной транскрипции, 1 ЕД фермента MMLV, смесь dNTP и реагента DTT в соответствии с инструкцией к набору (набор MMLV RT Kit, ООО "Евроген Лаб", Москва).

Затем проводили RT-qPCR с использованием интеркалирующего красителя Sybr.

Праймеры были подобраны с использованием программы ProbeFinder

(https://lifescience.roche.com/en_us/brands/universal-probe-library.html) и

синтезированы на базе ООО "Евроген Лаб". В качестве генов-рефери (housekeeping) использовали гены 18S, GAPDH, U6. Реакционная смесь для ПЦР содержала 5 мклPCRmix, смесь прямого и обратного праймеров, Sybr Green 0,5

мкл, кДНК 5 мкл, стерильная вода в объеме, необходимом до 25 мкл смеси.

Количественная ПЦР проводилась в триплетах на амплификаторе CFX-96 BioRad (USA). Расчет нормализованной экспрессии lncRNA относительно генов-рефери проводили с использованием ПО СFX Manager Bio-Rad Laboratories.

Последовательности праймеров приведены в таблице 5.

Таблица 5. - Последовательности праймеров исследованных lncRNA

LncRNA	последовательность	Т отжига праймеров
HOTAIR	F 5'-AGT TCC ACA GAC CAA CAC CC-3'	60
	R 5'-CGT TCC ATT CCA CTG CGA AG3'
PVT1	F 5'-TGA CTC TCC TTG TCA TGA GCC-3'	60
	R 5'- ACT TGA ACG AAG CTC CAT GC-3'
MALAT	F 5'-TTG CCA CTT CTC AAC CGT CC-3'	60
	R 5'- TCA AAC ACC TCA CAA AAC CCC-3'

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

56

2.5 Определение содержания цитокинов, циркулирующих в крови

Уровни IL-17A (ООО Цитокин) и IL-18 (ЗАО Вектор-Бест-Волга) в крови и асците оценивали сэндвич-методом иммуноферментного анализа.

Содержание белков было посчитано в пг/мл.

2.6. Статистическая обработка полученных данных

Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах

Microsoft Office Excel 2016. Для статистической обработки использовались программы Statistica 13.5.0 (TIBCO Software Inc), jamoviVersion 1.8.4.0. Для графического представления данных также применялась программа

GraphPadPrism 9.

Подсчет требуемого размера выборки осуществлялся с помощью программы G*Power 3 с учетом предполагаемой мощности исследования 80%,

вероятности ошибки первого рода на уровне 5%. Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению, для этого использовался критерий Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерий Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых более 50).

Совокупности количественных показателей, распределение которых отличалось от нормального, описывались при помощи значений медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1-Q3). Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей. Для уточнения формы распределения использовалась графическая подгонка распределений.

Выбор статистических критериев осуществлялся с учетом типа переменных

(количественные, ранговые либо номинативные) и распределения количественных переменных. Для сравнения независимых совокупностей в случаях отсутствия признаков нормального распределения данных использовался

U-критерий Манна-Уитни. При сравнении нескольких выборок количественных данных, имеющих распределение, отличное от нормального, использовался

57

критерий Краскела-Уоллиса, являющийся непараметрической альтернативой однофакторного дисперсионного анализа.Анализ связи номинативных переменных осуществлялся с помощью критерия согласия Пирсона (хи-квадрат) в

случае достаточного количества данных и точного критерия Фишера при малом количестве данных (менее 5 наблюдений в любой из ячеек четырехпольной таблицы). Для проверки различий между двумя сравниваемыми парными выборками нами применялся W-критерий Уилкоксона.

Для оценки корреляции между ранговыми и количественными переменными использовался непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Значения коэффициента корреляции rxy интерпретировались в соответствии со шкалой Чеддока:

Значения коэффициента	Характеристика тесноты
корреляции rxy	корреляционной связи
менее 0,1	связь отсутствует
0,1-0,3	слабая
0,3-0,5	умеренная
0,5-0,7	заметная
0,7-0,9	высокая
0,9-0,99	весьма высокая

Для оценки взаимосвязей между двумя количественными переменными также применялась простая линейная регрессия.

Для объединения показателей по группам, исходя из их сходства, нами применялся иерархический кластерный анализ и факторный анализ. Факторный анализ проводился в четыре стадии: вычисление корреляционной матрицы;

извлечение факторов методом главных компонент; вращение факторов для создания упрощенной структуры по методу Варимакс; анализ матрицы факторных нагрузок и интерпретация.

Для графического представления количественных переменных применялись диаграммы типа boxplot, в которых центральной линией обозначалась медиана,

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

58

нижним и верхним ограничителями «ящика» ‒ величины стандартной ошибки либо 25 и 75%, а нижней и верхней поперечной чертой на границе графика ‒ величины стандартного отклонения либо минимальные и максимальные значения;

а также диаграммы рассеяния, корреляционные матрицы и диаграммы типа piechart.

Предварительный статистический анализ случаев рецидива/прогрессирования опухоли включал в себя анализ кривых выживаемости без прогрессирования по методу Каплана-Майера. Выживаемость без прогрессирования определялась как время от включения в исследование до прогрессирования либо смерти (FDA,

2007). Сравнение двух кривых проводилось с помощью логрангового критерия;

трех кривых - критерия Гехана. Применяли правое однократное цензурирование по дате последнего контакта с пациенткой. Цензурированными считали пациенток, у которых на протяжении наблюдения не произошел рецидив либо прогрессирование болезни. В случаях, когда медиана выживаемости в группах была достигнута, описание результатов проводилось с использованием медиан выживаемости. Анализ выживаемости пациентов проводился также по методу регрессии Кокса, подразумевающему прогнозирование риска рецидива и оценку влияния на него независимых предикторов.

Так как популяции по оценке прогностического потенциала циркулирующих опухолевых клеток и потенциала циркулирующих в крови цитокинов/длинных некодирующих РНК полностью или частично совпадали, в случае данных сравнений для коррекции family-wiseerrorrate использовался нисходящий метод Холма-Бонферрони. Различия между группами во всех случаях считались статистически значимыми при p<0,05.

59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ИИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Клинические характеристики пациенток

Рассмотрим характеристики пациенток с раком яичников, включенных в исследование, представлены в таблице 6.

Таблица 6. – Общая характеристика пациенток, включенных в исследование

Клиническая характеристика	Число пациенток
	(всего 114)
	абс.		%
1	2		3
1. возраст, медиана (IQR Q1-Q3)	57 (50.5-67.25) лет
2. Стадия FIGO
I	10		8,8
II	4		3,5
III	63		55,3
IV	37		32,5
3. Стадия TNM – T
T1	10		8,8
T2	5		4,4
T3	99		86,8
4. Стадия TNM – M
M0	75		65,8
M1	39		34,2
5. Наличие асцита при первичной диагностике
да	89		76,6
нет	25		23,4
6. Гистологический подтип
серозный highgrade	61		53,5
серозный lowgrade	4		3,5
муцинозныйlowgrade	2		1,8
эндометриоидныйhighgrade	2		1,8
светлоклеточный	3		2,6
недифференцированный	4		3,5
не получен гистоанализ (цитологическая верификация)	34		29,8
не установлен подтип по причине патоморфоза CRS 3	4		3,5
7. Лечебный патоморфоз (определяли у 33 пациенток), балл CRS
0	6		18,2
1	4		12,1

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

60

1	2		3
2	15		45,5
3	8		24,2
8. Режим химиотерапии
неоадъювантная	81		71,1
адъювантная	33		28,9
9. Циторедуктивная операция
проводилась	73		63,7
не проводилась	41		36,3
10. Уровень СА-125 в крови до лечения, медиана (IQR	446 (203-1227)
Q1-Q3)		МЕ/мл
11. Число лейкоцитов в крови до лечения, медиана (IQR	7,0 (6,1-9,2) *109/л
Q1-Q3)
12. Число тромбоцитов в крови до лечения, медиана	327 (250-421) *109/л
(IQR Q1-Q3)
13. Скорость оседания эритроцитов до лечения, медиана	29 (12-41) мм/ч
(IQR Q1-Q3)
14. Индекс массы тела до лечения, медиана (IQR Q1-Q3)	27 (23-31) кг/м2

В таблице 7 представлены сопутствующие негинекологические заболевания, встречавшиеся у участниц исследования.

Таблица 7. – Сопутствующие негинекологические заболевания у пациенток, включенных в исследование

					Сопутствующие заболевания
Заболевание	ГБ		ИБС		ФП		ВБ ВНК			СД 2 типа		атеросклероз			ЖКБ
Число пациенток	66	10		3			27			13		12			7
					Сопутствующие заболевания
Заболевание	МКБ		ГА		ДК			узловой зоб			ГЭРБ		НАЖБП	эпилепсия
Число пациенток	4		3		3			3			7		2		1

ГБ – гипертоническая болезнь, ИБС – ишемическая болезнь сердца, ФП – фибрилляция предсердий, ВБ ВНК – варикозная болезнь вен нижних конечностей, СД – сахарный диабет, ЖКБ – желчнокаменная болезнь, МКБ – мочекаменная болезнь, ГА – гонартроз, ДК– дивертикулез кишечника, ГЭРБ – гастроэзофагеальнаярефлюксная болезнь, НАЖБП – неалкогольная жировая болезнь печени.

Из гинекологической патологии в анамнезе у 25 пациенток диагностировалась миома матки, у 2 – внематочная беременность, у 5 –

перенесенный острый аднексит.

У трех пациенток в анамнезе был рак молочной железы (РМЖ)

люминального А подтипа, по поводу которого они получали хирургическое лечение и гормонотерапию тамоксифеном. Все эти пациентки на момент