Этапы выделения чистых культур микроорганизмов

 

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

 

 

Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные,плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятою в виде соска серединой.

Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth – гладкий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый, неравный).

Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, гирозной, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с  посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 год.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.

Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.

Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.

В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

 

 

 

Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы,каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).

Определение вида возбудителя за его биохимическими свойствами называется биохимической идентификацией.

Для исследования способности бактерий расщеплять белки (протеолитические свойства) используют молоко или среду с желатином. Протеолиз в молоке выражается растворением сгустка казеина, который образован бактериями, которые свертывают молоко.

Среды с желатином готовят на мясной воде, добавляя 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрия и 10-20 % желатину. Занял делают уколом. Протеолиз проявляется разжижением столбика среды. Поскольку некоторые виды бактерий отличаются за особенностями разжижения желатина, этот признак можно учитывать при их идентификации.

Пептолитические свойства (способность расщеплять пептоны – продукты неполного гидролиза белка) обнаруживают с помощью МПБ и пептонной воды. Их засевают микроорганизмами, а затем определяют образование конечных продуктов – аммиаку, сероводороду и индолу. Для нахождения аммиака в пробирку вставляют и притискивают пробкой красную лакмусовую бумажку. В атмосфере аммиака он приобретает синюю расцветку. Индикатором на сероводород является раствор ацетата свинца, который при аналогичных условиях определения окрашивает фильтровальную бумагу, смоченную индикатором, в черный цвет за счет образования сульфида свинца.

Индол можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной 12 % раствором щавелевои кислоты. За наличием индолу бумажка приобретает розовый цвет. Чувствительнее является метод Ерлиха. Согласно с общепринятым методом пробкой пробирки притискивают бумажку, пропитанную специальным индикатором (спиртной раствор парадиметиламидобензальдегиду). При наличии индолу цвет его изменяется на сиренево розовый или малиновый. В другом варианте определения индолу до 48-часовой бульйоннои культуры бактерий добавляют 1-2 мл серного эфира, а затем – реактив Эриха. В нижней части слоя эфира за 1-2 мин появляется яркое малиновое кольцо.

В микробиологической практике широко используются дифференциально диагностические среды Ендо, Левина, Плоскирева, которые позволяют обнаружить разложение лактозы бактериями. Они позволяют проводить первичную дифференциацию бактерий кишечного тракта, что чрезвычайно важно для быстрого выделения чистых культур с их следующей идентификацией. Эти среды есть елективними для многих представителей семьи кишечных бактерий. Выпускаются они в сухом виде, потому их приготовление в лабораториях не нуждается в затрате времени.

Среда Эндо состоит из сухого питательного агара, 1 % лактозы и индикатора фуксина, обесцвеченного раствором сульфита натрия. Свежая среда имеет слабую розовую расцветку. При росте лактозопозитивних микроорганизмов, тех, которые расщепляют лактозу (E. coli), их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Колонии лактозонегативних микробов (сальмонели, шигели) на этой среде бесцветны.

В состав среды Левина также входит МПА, лактоза, одинзамещенный фосфат калия, индикаторы метиленовий синей, эозин. Нативне среда имеет фиолетовый цвет. Колонии лактозопозитивных бактерий имеют темно-синюю расцветку, а лактозонегативные – розовый оттенок.

Сухой бактоагар Плоскирева (Бактоагар Же) содержит в составе агар с солями желчных кислот лактозу, цитрат натрию, гипосульфит, фосфат натрия,брильянтовый зеленый, соду кальцинированную, йод и нейтральный красный. Микроорганизмы, которые расщепляют лактозу, образуют колонии розового цвета, а те, что ее не ферментируют – бесцветные.

В микробиологической практике часто возникает потребность исследовать ферментацию не только одного, а нескольких цукрив сразу. С этой целью используют среды Гисса. Они могут иметь жидкую и полужидкую консистенцию.

Основой жидкой среды является 1 % пептонная вода с 0,5 % натрию хлорида, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, манниту и др.). К нему добавляют индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NаOH). Устанавливают рН 7,2, при нем среда имеет желтый цвет. Среды с разными углеводами разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают поплавок – запаянную из одного конца стеклянную трубочку длиной 3 см открытым концом книзу. Стерилизуют парой под давлением 0,5 атм 15 мин.

После посева бактерий, если они ферментируют углеводы, наблюдают появление красной расцветки, которая свидетельствует об изменении рН в кислую сторону (образование кислоты), а порой из поплавка вытесняется жидкость. Тогда делают вывод об образовании газа. Следовательно, возможны три варианта при учете результатов посева на середовише Гисса: микроорганизмы не ферментируют  субстрату (негативный ответ) или бактерии раскладывают углеводы (позитивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа.

Учитывая, что микроорганизмы по-разному действуют на углеводы (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жидкости. Это создает впечатление пестрости, а такой ряд называют пестрым рядом Гисса.

В настоящий момент в большинстве случаев пользуются набором сухих сред для определения цукролитичних ферментов, из которых готовят полужидкие пестрые ряды. В отличие от предыдущей группы, в их состав входят индикаторы ВР (смесь водного голубого с розоловою кислотой) или бромтимоловий синей илибромкрезоловий пурпурный. При наличии газа наблюдаются пузырьки или разрывы питательной среды в толще агара. При пидкисленни среды с индикатором ВР оно становится синим, а при пидлужнюванни – красным (бромкрезоловий пурпурный при образовании кислоты дает кое-что фиолетовая и лимонно-желтая расцветка, а бромтимоловий синей – зеленкувате или лимонное). В щелочной среде они имеют соответственно интенсивно фиолетовый и синий цвет с зеленкуватимбликом.

Выпускаются также сухие среды Рессела и сахарный агар с мочевиной Олькеницкого.

Среда Рессела является полужидким агаром с лактозой (1 %) и глюкозой (0,1 %) и индикатором ВР. После разливания его в пробирки их кладут так, чтобы образовался столбик агара и была скошена поверхность. Микроорганизмы засевают петлей сначала уколом в столбик, а затем по скошенной поверхности. Если бактерии ферментируют  лактозу и глюкозу, наблюдают изменение цвета (подкисление) всей среды на синей. Если микробы способны метаболизировать только глюкозу, в этом случае изменяет цвет столбик среды. При условии образования газа наблюдают за появлением его пузырьков или разрывами агара.

Трисахарный агар с мочевиной Олькеницкого – более сложная среда сравнительно с предыдущим. Он позволяет определить ферментацию лактозы, сахарозы, глюкозы, образования сероводорода и наличие у бактерий фермента уреазы. В состав среды соответственно вводят сухой питательный агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексную соль аммоний-железо сульфат, тиосульфат натри, мочевину, индикатор феноловый красен. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

При расщеплении сахаров феноловый красный окрашивает среду в желтый цвет. Поскольку глюкоза, имеющаяся в небольших концентрациях (0,1 %), в аэробныхусловиях (скошенная поверхность) бактерии полностью будут утилизировать ее за первые часы роста. Через 18-24 год они потребляют и пептоны как белковую питательную основу. При этом образуется аммиак, который делает среду щелочной, предоставляя ей красного цвета. Однако в столбике агара желтый цвет остается, потому что там сохраняются кислые конечные продукты, которые обеспечивают низкий уровень рН.

Энтеробактерии, которые разлагают лактозу и глюкозу, подкисляют среду во всей пробирке (желтый цвет столбика и скошенной поверхности). Поскольку лактозы (1 %) в 10 раз больше, чем глюкозы, через 18-24 год инкубации ее запасы еще не исчерпаны, потому сохраняется желтый цвет среды. Однако через 48 год за счет расщепления пептонов можно наблюдать за его покраснением (сдвиг рН в щелочную сторону).

Если бактерии образуют газ (углекислый, водород) при ферментации сахаров, появляются разрывы среды или происходит скопление газа на дне, который поднимает агар в пробирке.

Сероводород микробы образуют из неорганических соединений, благодаря ферменту тиосульфатредуктазе. Взаимодействуют с сероводородом соли железа, которые, вступая с ним в реакцию, образуют сульфид железа в виде нерастворимого преципитата черного цвета в столбике.

Уреаза, которую продуцируют бактерии, разрушает мочевину с выделением большого количества аммиаку, под воздействием которого вся среда алеет. Потому при наличии уреазопозитивних штаммов провести учет ферментации цукрив невозможно. В таких случаях необходимо использовать другие среды.

 

За последние годы в практике микробиологических лабораторий начали использовать специальные тест-системы для определения разнообразных свойств бактерий: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластины и диски индикаторные биохимические. Они удобны для пользования, надежные, позволяют определять 12-20 и больше разнообразных признаков, значительно облегчить идентификацию микробов.

Гемолитическая активность микроорганизмов является одним из самых существенных признаков их вирулентности, потому ее определение стало рутинной процедурой любой специализированной лаборатории. С этой целью используют кровяной МПА. Его готовят из растопленного и охлажденного до 45-50 °С питательного агара, к которому добавляют 5-10 % дефибринованои или свежей крови животного (барана или кролика). Агар с кровью тщательным образом перемешивают, не допуская образования пены, и разливают в чашки Петри. Если бактерии продуцируют гемолизини, вокруг колоний или штрихов посева образуются зоны просветления на матовом красном фоне . По цвету гемолиза (бесцветный, зеленоватый) можно определить тип гемолизинов (альфа-, бета-, гамма-, дельта- и тому подобное).

Чтобы обнаружить липолитические свойства микробов, в состав питательных сред вводят липиды или жироподобные субстанции – твини. Бактерии при таких условиях образуют радужные венчики вокруг колоний при расщеплении липидов.

Редуцирующие свойства изучают, добавляя в состав сред красители (метиленовий синей, например), которые способны возобновляться. Фиксируя время изменения цвета индикатора, можно судить о степени выражение редуцирующей активности.

Декарбоксилазную активность бактерий оценивают на специальных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, глютаминовой кислотой и др.) и соответствующими индикаторами.

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию за антигенными свойствами. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи ентеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигели) содержат оболочковый О-антиген, джгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны за своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологическойидентификации. Ее относят к одному из главных методов установления вида выделенной культуры. Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации на стекле. С этой целью на предметное скельце наносят разные диагностические сыворотки (против отдельных возбудителей или их антигенов), а затем в каждую каплю вносят стерильной петлей небольшое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за феноменом агглютинации. Образованиеаглютинату (хлопьев) свидетельствует о гомологичнисть антигенов возбудителя и антител диагностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекционного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции агглютинации ее ставят в развернутом варианте (реакция агглютинации Грубера).

При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) идентификацию проводят за токсигенными свойствами микробов. Метод основывается на определениитоксигенной активности коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумажкой, пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитивной реакции.

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствами. Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.

Очень важным при выделении микроорганизмов является определение их чувствительности к антибиотикам с целью выбора оптимального препарата для лечения. Чаще всего пользуются методом стандартных дисков (метод диффузии в агар, диско-дифузийний метод). Для этого на поверхность специальной плотной питательной среды в чашках Петри засевают культуру микроорганизмов и налагают бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. Посевы инкубируют при оптимальной температуре 18-24 год и измеряют зоны задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. За размерами этих зон определяют принадлежность бактерий к чувствительным, умеренно резистентным или стойким штаммам.

На основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных, биологических и других свойств микробов делают окончательный вывод об идентификации. Например: “Выделено Escherichia coli” или “Выделенный возбудитель принадлежит к виду Staphylococcus epidermidis”.

 

 

Запомните этапы выделения чистых культур аеробних бактерий:

1 - макро- и микроскопическое изучение  исследуемого  материала  и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.

2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;

3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 - вывод о выделенной культуре.