6. Високоефективна рідинна хроматографія

Рідинна хроматографія – це метод розділення і аналізу складних сумішей, в якому рухомою фазою є рідина. Він застосовується для розділення більш широкого кола речовин, ніж ГХ, оскільки більшість речовин є нелеткими, багато які з них є нестійкими при високих температурах (особливо ВМС) і розкладаються при переведенні в газоподібний стан. В РХ розділення найчастіше відбувається при кімнатній t.

Базується на адсорбції з розчину. Адсорбційна рівновага між розчином і адсорбентом підчиняється рівнянню ізотерми адсорбції Ленгмюра, в області розведених розчинів ізотерма лінійна. Селективність адсорбції залежить від природи сил взаємодії між адсорбованими речовинами і адсорбентом.

Ефективність хроматографічної колонки залежить, головним чином, від процесів дифузії і масопереносу в обох фазах і визначається, як і в газовій хроматографії, висотою еквівалентною теоретичній тарілці (ВЕТТ) Н. З лінійною швидкістю рухомої фази U і деякими іншими величинами ВЕТТ зв’язана рівнянням

H = 2Rr(1 – Rr)Uts

де

де t_m – середній час між десорбцією і повторною адсорбцією молекули речовини, коли вона рухається із швидкістю рухомої фази U;

t_s – середній час перебування молекули в нерухомій фазі.

Таким чином, з ростом лінійної швидкості руху рухомої фази ВЕТТ зростає і, відповідно, ефективність колонки зменшується.

В класичному варіанті РХ в скляну колонку l = 1-2 м, заповнену сорбентом (розмір частинок  100 мкм), вводять аналізовану пробу і пропускають елюент. Швидкість проходження елюента під дією сили тяжіння мала, а тривалість аналізу велика. Внаслідок використання сорбентів з розміром зерен 10-30 мкм, поверхнево- і об’ємно-пористих сорбентів з розміром частинок 5-10 мкм, насосів, чутливих детекторів відбувся перехід від класичної до ВЕРХ. Швидкий масоперенос при високій ефективності розділення дозволяє використати ВЕРХ для розділення і визначення молекул (адсорбційна і розподільча хроматографія), для розділення і визначення іонів (іонообмінна, іонна, іон-парна хроматографія), для розділенні макромолекул (ексклюзийна або гель-хроматографія). Методами афінної і лігандообмінної хроматографії розділяють БА молекули і оптичні ізомери.

Адсорбційна хроматографія

Нормативно-фазова обернено фазова

хроматографія хроматографія

– полярний адсорбент – неполярний адсорбент

– неполярна рухома фаза – полярна рухома фаза.

Вибір рухомої фази завжди важливіший, ніж вибір нерухомої

Нерухома фаза повинна утримувати розділювані речовини. Рухома фаза, тобто розчинник, повинна забезпечити різну ємкість колонки і ефективне розділення за оптимальний час.

Нерухома фаза – пористі тонкодисперсні матеріали з питомою поверхнею більше 50 м2/г.

полярні неполярні

SiO2, Al2O3, MexOy, флоросил графітована сажа, кизельгур,

і т.д. диатоміт.

а також з привитими (Не маютьселективності

полярними групами до полярних молекул).

(Для розділення неполярних –NH2

і малополярних, середньоїполярності речовин).

Вказані сорбенти наносяться на поверхнево-пористі носії.

Рухома фаза. Від неї залежить:

– селективність розділення;

– ефективність колонки;

– швидкість руху хроматограмної смуги.

Вимоги до рухомої фази:

1) повинна розчиняти аналізовану пробу;

2) мала в’язкість (Ддиф. компонентів проби достатньо високі);

3) можливе виділення з неї розділених компонентів;

4) інертна по відношенню до матеріалів всіх частин хроматографа;

5) відповідає вимогам вибраного детектора;

6) безпечна;

7) дешева.

Як було сказано, елююча сила рухомої фази – розчинника впливає на розділення.

Елююча сила розчинника показує, у скільки разів енергія сорбції даного елюєнта більша, ніж енергія сорбції елюента, вибраного в якості стандарту, наприклад, н-гептану. Розчинники (елюенти) ділять на слабкі і сильні.

Слабкі елюенти мало адсорбуються нерухомою фазою, тому Д сорбата високі.

Сильні елюенти сильно адсорбуються нерухомою фазою, тому коефіцієнт розподілу сорбованих речовин (сорбата) низькі.

Наприклад: SiO₂ – нерухома фаза.

Сила розчинників збільшується в ряду:

пентан (0)  CCl₄ (0,11)  C₆H₆ (0,25)  CHCl₃ (0,26)  CH₂Cl₂ (0,32)  ацетон (0,47)  діоксан (0,49)  ацетонітрил (0,5)  етанол  метанол.

В якості міри відносної полярності приймають шкалу Гільдебранда.

Розміщення розчинників у відповідності із зростанням їх елюючої сили називають елюотропним рядом. В рідинній адсорбційній хроматографії елюотропний ряд Снайдера має вигляд: пентан (0)  н-гексан (0,01)  циклогексан (0,04)  CCl₄ (0,18)  бензол (0,32)  CHCl₃ (0,38)  ацетон (0,51), етанол (0,88)  вода, СН₃СООН (дуже велика).

Для обернено-фазової хроматографії на С₁₈ елюотропний ряд має вигляд: метанол (1,0)  ацетонітрил (3,1), етанол (3,1)  ізопропанол (8,3)  н-пропанол (10,1)  діоксан (11,7).

Часто застосовують не окремі розчинники, а їх суміші. Незначні кількості доданих інших розчинників, особливо води, істотно збільшують елюючу силу елюента.

При розділенні багатокомпонентних сумішей одна рухома фаза в якості елюента може не розділити всі компоненти проби за достатньо оптимальний час. Тоді використовують метод ступінчатого або градієнтного елюювання. Для збільшення сили елюента в процесі хроматографування послідовно застосовують все більш сильні елюенти. Це дозволяє елюювати все більш сильно утримувані речовини за менший час.

Існують емпіричні правила, які допомагають при виборі елюента. Сорбція, як правило, зростає з ростом числа подвійних зв’язків і ОН-груп в сполуках. Сорбція зменшується в ряду органічних сполук: кислоти  спирти  альдегіди  кетони  складні ефіри  ненасичені вуглеводні  насичені вуглеводні.

Для розділення речовин різної полярності і для розділення сполук різних класів застосовують нормально-фазову хроматографію: з неполярних рухомих фаз сполуки різних класів виходять з колонки з полярним адсорбентом за різний час (час утримування сполук з різними функціональними групами збільшується при переході від неполярних сполук до слабкополярних). Для дуже полярних молекул t_R дуже великі і аналіз при використанні неполярного елюента неможливий. Для зменшення часу утримування полярних сорбатів переходять до полярних елюентів. В обернено-фазовому варіанті нерухома обернена фаза сильніше адсорбує неполярні компоненти з полярних елюентів, наприклад з води. Знижуючи полярність елюента додаванням менш полярного розчинника (метанол), можна зменшити утримування компонентів.