5.4. Определение активности щелочной фосфатазы

Принцип метода: ЩФ расщепляет в глициновом буфере 4-нитро-фенилфосфат с образованием 4-нитрофенола и фосфата. Мерой каталитической активности фермента является количество осво­божденного 4-нитрофенола.

Реактивы.

• Субстрат 4-нитрофенилфосфат, 0,92

• Буфер глициновфй,

• Стандартный раствор, 4-нитрофенол, 2,4 ммоль/л,

• Вспомогательный реактив – раствор ингибитора

Ход исследования.

Длина волны 405—430 нм, кювета 1 см, температура 37 °С.

Кинетический метод.

В кювете, выдержанной до постоянной температуры 37 °С, смешивают 1 мл реактива 2 и 0,02 мл пробы сыворотки. Смесь предварительно инкубируют не менее 5 мин, после чего стартуют реакцию 0,2 мл раствора 1, предварительно выдержанного до одинаковой температуры. Измеряют оптическую плотность в интервале от 30-й до 210-й с через каждые 60 с и вычисляют изменение оптической плотности ∆А за 1 мин.

Каталитическую концентрацию ЩФ в пробе рассчи­тывают по формуле:

ЩФ(мккат/л) = 56,100 × ∆А(405нм); 59,389 × ∆А (410нм);

72,796 × ∆А (420 нм); 103,174 × ∆А (430 нм).

Метод постоянного времени.

Определение проводят по схеме, приведенной в таблице.

Отмерить (мл)	Проба		Контрольный раствор
Реактив 2 (буфер) Сыворотка крови	1,00 0,02		1,00 —
Перемешивают, инкубируют 5 мин при 37°С и прибавляют
Раствор 1 (субстрат)	0,20	0,20
Инкубируют точно 10 мин при 37°С и прибавляют
Раствор ингибитора Сыворотка крови	0,5 -	0,5 0,02
Перемешивают и до 30 мин измеряют оптическую плотность пробы А1 и контрольного раствора А2 против воды и вычисляют разность оптических плотностей (А1 – А2) - ∆А

Каталитическую концентрацию ЩФ в пробе рассчитывают по формуле:

ЩФ(мккат/л) = 7,899 × ∆А(405 нм); 8,373 × ∆А (410 нм);

10,263 × ∆А (420нм); 14,456× ∆А (430нм).

Можно определить собственный калибровочный фактор, действительный для условий каждой лаборатории.

Фактор для кинетического определения:

1 мл реактива 2 сме­шивают с 0,2 мл дистиллированной воды и 0,02 мл реактива стандарта. Измеряют оптическую плотность А против воды. F= 40/А.

Фактор для метода постоянного времени:

1 мл реактива 2 смешивают с 0,2 мл дистилированной воды, 0,02 мл реактива 3 (стандарта), прибавляют 0,5 мл раствора ингибитора и измеря­ют оптическую плотность А против воды. F = 4/А.

Референтные величины: Активность ЩФ при 37 °С у мужчин равна 0,90—2,29; у женщин 0,74—2,10; у детей 1,20—6,30 мккат/л.

Клиническое значение.

Возрастание активности ЩФ встречается главным образом у больных с двумя видами патологии: костными заболеваниями, связанными с пролиферацией остеобластов, и заболеваниями, сопровождающимися явлениями холестаза.

5.5.Определение активности а-амилазы методом Каравея (микрометод).

Принцип метода: метод базируется на колориметрическом определении концентрации крахмала до и после его ферментативного гидролиза.

Реактивы:

• раствор субстрата рН = 7,2-7,4

• 0,1% основной раствор йода и йодистого калия

• рабочий 0,01N раствор йода.

Примечания:

1. Слабый гемолиз не мешает исследованию.

2. Лимоннокислую и щавелевокислую плазму и плазму, приготовленную на ЭДТА, применять нельзя, так как цитраты, оксалаты и ЭДТА. ингибируют активность фермента.

3. При активности фермента выше 30 г/(ч•л) в сыворотке крови и выше 140 г/(ч•л) в моче, сыворотку или мочу следует развести водой, что соответственно должно учитываться при расчете активности ферментов. В случае высокой гиперферментамии мочу разводят в 100 раз.

4. При определении амилазной активности нужно иметь в виду, что слюна содержит в 1000 и более раз больше фермента, чем сыворотка. Пот также обладает амилазной активностью, и при попадании его с кожных покровов в пробирку (при перемешивании проб большим пальцем) активность амилазы завышается на 25-80%.

Ход определения.

В обычную химическую пробирку вносят 1 мл раствора крахмала, субстрат прогревают 5 мин в водяной бане при 37 °С, после чего к нему добавляют 0,02 мл сыворотки (мочи или другой биологической жидкости). Пробу вновь помещают ровно на 5 мин в водяную баню (в суховоздушном термостате для этого должны быть баночки с водой). Контрольную пробу проводят так же, как опытную, но исследуемую биологическую жидкость в нее вносят после добавления раствора йода. Затем во все пробирки (опытные и контрольные) доливают по 1 мл рабочего раствора йода и по 8 мл дистиллированной воды, перемешивают стеклянной палочкой и колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (630—690 нм) в кювете с ши­риной слоя 10 мм против дистиллированной воды. Рассчитывают активность а-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при +37 °С по формуле:

А_к – А_оп × 240

А_к

где 240 = 0,4 х 600; 0,4 — количество крахмала (мг), внесенного в опытную и контрольную пробы, 600 = 50 х 12 (50 — коэффициент пересчета на количество крахмала в г, гидролизованного 1 л сыворотки; 12 — коэффициент пересчета с 5 мин на 60 мин).

Норма: активность фермента в сыворотке крови равна 16— 30 г/(ч • л), в моче 28—160 г/(ч • л).

Клиническое значение.

Значительное возрастание активности фермента встречается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы. При остром панкреатите активность фермента крови и мочи увеличивается в 10—40 раз. Гиперамилаземия наступает в начале заболевания, достигает максимума к 12—24 ч после развития панкреатита, затем быстро снижается и приходит к норме на 2— 6-е сут.