1. Распределение протонов- в качестве примера рассмотрим

108

Активность, ЮОг

50

6

8

ТО рН

Рис. !8. Гипотетические рН-зависимости каталити­ческой активности свободного (нейнмобилизован­ного) фермента (кривая 2), иммобилизованного из поликатионном (кривая J), полианионном (кри­вая 3) носителях

фермент, иммобилизованный на гшлиэлектролнтном носителе. Пусть для определенности оптимум действия фермента в гомо­генном растворе наблюдается при рН 8, а кривая зависимости ак­тивности от рН имеет колоколообразный вид (кривая 2 на рис. 18). Если для работы с иммобилизованным ферментом значение рН во внешнем растворе выбрать равным 8, то из-за эффекта распре­деления протонов внутри полиэлектролитной матрицы оно будет другим. Так» если фермент иммобилизован на полнанионном носи­теле, то внутри него концентрация протонов выше, чем во внешием растворе (сдвиг в сторону более кислых значений рН); обратная картина имеет место в случае поликатионного носителя. Это при­ведет к тому, что фермент» иммобилизованный как на поликатнон-ном (кривая / на рис. 18)_т так н на лолианионном (кривая 3 на рис. 18) носителе, будет работать не с полной эффективностью, хотя значение рН во внешнем растворе соответствуюет оптимуму его каталитической активности.

Подобные изменения рН~зависимостн ферментативной актив­ности часто наблюдаются в реальных системах. Они целиком обу­словлены присутствием на полиэлектролитном носителе заряжен­ных групп. Добавление в систему с иммобилизованным ферментом высококонцентрированных растворов солей или буферных систем вызывает экранирование зарядов групп носителя и, следователь­но, уменьшение сдвигов рНчэптимумов активности. Иными слова­ми, сдвиг рН-зависимостей активности иммобилизованных фер­ментов, обусловленный распределением протонов, наблюдается только в разбавленных буферных растворах с низкой ионной си-лой. С другой стороны, зависимость сдвига рН-оптимума актив­ности от ионной силы служит серьезным указанием на то, что распределение протонов между раствором и носителем играет

109

важную роль в катализе иммобилизованным препаратом фер­мента,

2. Ограничение диффузии протонов. Полимерный носитель, на котором иммобилизован фермент, может препятствовать свобод­ной диффузии протонов внутри частицы носителя. Это связано с тем, что внутри частицы носителя существенно заторможена диффузий протонов по механизму, характерному для гомоген­ного раствора. Поскольку концентрация протонов в системе обычно мала (10~⁷ моль/л или ниже), то даже небольшой избы­ток (или, наоборот, дефицит), обусловленный торможением диф­фузии, может вызвать заметное изменение рН внутри частицы. Это, в свою очередь, приведет к существенному изменению рН-зави си мости каталитической активности, особенно для т,ех фер­ментативных реакций, и которых протоны являются субстратом или продуктом (как₍ например, при действии гидролаз, дегндро-геназ, киназ и некоторых других ферментов).

Пусть, например, фермент, иммобилизованный на носителе, катализирует реакцию» сопровождающуюся образованием про­тонов, в отсутствие буферного раствора. После начала реакции в матрице начинают накапливаться протоны, что приводит к по­явлению градиента концентрации протонов и последующей их диффузии ня частицы во внешний раствор. Однако если диффу­зия заторможена, то протоны накапливаются внутри частицы и вызывают уменьшение рН в микроокружении фермента. Это, в свою очередь, влияет на скорость ферментативной реакции, а значит, и на скорость выделения протонов — продукта фермента­тивной реакции. Если рН внутри частицы до начала реакции вы­ше рН-оптимума фермента, то образующиеся в ходе реакции протоны снижают рН, повышая тем самым скорость фермента­тивной реакции, т. е. скорость выделения протонов. В результате значение рН частицы уменьшается еще сильнее, а скорость фер­ментативной реакции еще больше нозрастает. Иными словами, в такой системе будет наблюдаться явление автокатализа. Окон­чательно стационарное состояние будет достигнуто только тогда, когда значительное повышение концентрации протонов будет оказывать лишь незначительное влияние на скорость фермента-тивной реакции*.

Если значение рН начала реакции ниже рН-оптимума актив­ности, то по мере выделения протонов в ходе ферментативной реакции рН уменьшается еще сильнее и реакция замедляется. На графике рН-зависимости относительной ферментативной ак­тивности (рис. 19) это отразится следующим образом: ветви кри­вой, соответствующие низким значениям рН для иммобилизован­ного и нативного ферментов, практически совпадут, а «щелоч­ная» ветвь кривой (выше рН-оптимума активности) в случае иммобилизованного фермента существенно расширится (сравни

ВОЗМОЖНЫ CHiy*JH,HH, КО) Да CTdtUHHltipilOe СОСТОЯНИС |1С ДОСТИГАЕТСЯ

I¹ itum случае нзблкмикпия ko.il-б :ш" i- i процессы; и инк p"'ii т*йяп нщку НО

кривые 1 и 2). причем до та- Аит»«стк% кой степени, что может пре- юо вратиться ь плато (кри­вая 3). В предельном слу­чае, когда иммобилизован­ный фермент работает при рН ниже значения рН опти­мальной активности, рН-за­висимость активности может трансформироваться к виду (кривая 4), т. е. с достиже­нием плато. Чем существен­нее диффузионные ограниче­ния протонов в носителе и чем выше активность иммо­билизованного фермента, тем ниже будет высота плато на кривой 4. Если в ходе реак­ции происходит поглощение протонов, то будут наблю­даться обратные явления.

Таким образом, если в экслериме нте н аб л юд аютс я рН-зависимостн активности, аналогичные тем, что приве­дены на рис. 19_t то это ука­зывает на ограничения диф­фузии протонов в системе с иммобилизованным ферментом.

Ускорение диффузии протонов в присутствии буферных растворов. Если система с иммобилизованным ферментом {по­добная той, что была описана в конце предыдущего раздела)

3

РН

Рис. 19. Изменение рН-нрофидей активно­сти иммобилизованного фермента в ре­зультате ограничения диффузии протонов е частицах носителя.

Крмная / — свободный (не иммобилизован mlihJ фермент в растворе; кривая 2 - иммоСн лиэованн^й фермент пря слабых ограничениях в диффузии протонов; кривые 3 и 4 —■ нкмо-были зова нный фермент ло мере усиления огра-

ti В ДИффуЭНН HfJOTDHQU

РАСТВОР

Рис 20. Схематическое изображение процесса пере­носа притонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментом

111

Рис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в си­стеме с иммобилизованным ферментом, ни вид рН-зависимости его каталитиче­ской активности

Кривая 1 — свободный (не и м мобилизован­ный ) фермент в растворе; крннпя 2 -нымобилнзр ванный фермент при значи­тельных ограничения¹; в диффузии прото­нов: кривые 3 и 4 — иммобилизованный ферм«кт по мере снятий ограничении % диффузии протонов увеличивающимися концентрациями буферного раствора

работает в присутствии компо­нентов буферного раствора, то они, связывая образующиеся в ходе реакции протоны, могут переносить их, удалять из мик­роокружения фермента. Обу­словлено это тем, что на гра­нице раздела частица носителя/ /раствор создается градиент концентрации протонироваиной формы основной компоненты буферного раствора (ВН⁺). Это приведет к диффузии фор­мы ВН⁺ в свободный раствор, где за счет более высокого значения рН она продиссоци-ирует с высвобождением сво­бодной формы В, которая, в свою очередь, будет диффунди­ровать по градиенту концент­рации в частицу носителя (см. рис. 20). В системе, где свободная диффузи» протонов сильно ограничена (кривая 2 на рис. 21), добавление буфер­ного раствора может привести к смещению плато в сторону более высоких значении актив­ности и к появлению S-образ-ного характера у

ветви рН-зависимости (см. кривые 3, 4 на рис.

Таким образом, добавление буферных растворов в систему с иммобилизованным ферментом может «снимать» ограничения в диффузии протонов и приводить к увеличению ферментативной активности в области некоторых значений рН.

Сочетание эффектов распределения и диффузии протонов. Если в системе с иммобилизованным ферментом одновременно имеют место эффекты распределения протонов и ограничения их диффузии, то заранее трудно предсказать вид рН-зависи-мостн активности. Оба этих фактора могут действовать взаимо­согласованно: либо как синергисты (т.е. усиливать друг друга), либо как антагонисты (ослаблять действие друг друга). Возмож­но несколько различных вариантов: фермент иммобилизован на полианионном, поликатионном или нейтральном носителе, и катализируемая им реакция протекает с выделением или поглоще­нием протонов, либо вообше не сопровождается изменением их кон­центрации. Здесь не будут рассмотрены все эти возможные ва­рианты. Отметим, что только дли фермента, иммобилизованного на электронейтральном носителе и катализирующего процесс,

112

не сопровождающийся изменением концентрации протонов, не должно наблюдаться изменений рН-зависимости активности. Но даже в такой системе вид кривой зависимости активности фермента от рН может измениться, если лимитирующей стадией реакции является диффузия субстрата.

Эффекты ингибированкя и активации в катализе иммобили­зованными ферментами. Полимерный носитель может вносить свою специфику и в действие таких регуляторов ферментативной активности, как ингибиторы и активаторы.

Низкомолекулярные ингибиторы и активаторы. Влияние и из ко -молекуляриого ингибитора на фермент определяется, в основном, распределением молекул ингибитора между фазой носителя и раствором. Диффузионные ограничения, как правило, не изме­няют характер ингибирования фермента после достижения ста­ционарного СОСТОЯНИЙ.

Наиболее прост для анализа тот случай, когда носитель не накладывает ограничения на диффузию субстрата и характер ингибирования целиком определяется распределением субстрата и ингибитора между матрицей и раствором. Если ингибитор и полимерный носитель одноименно заряжены, то степень ингибирования снижается {по сравнению с ситуацией в гомо­генном растворе), а если они несут на себе заряды противо­положного знака, то степень ингибирования возрастает. Если в последнем случае субстрат имеет одинаковый заряд с носи­телем, то степень ингибирования еще более увеличивается. В данном изложении не будут рассмотрены конкретные примеры: случаи конкурентного и неконкурентного ннгибирования, ингиби­рования продуктом реакции и т. п. Читатель ножет это проделать сам в качестве упражнения и вывести соответствующие матема­тические выражения. Анализ этих систем показывает, что во всех случаях кинетика действия иммобилизованных ферментов, осложненная ингибированием, описывается уравнением Миха-элнеа — Ментен.

Несколько более сложную задачу представляет описание ингибирования при наличии диффузионных ограничений для субстрата. Можно показать, что при очень сильном ограничении диффузии субстрата иммобилизованный фермент может вообще не реагировать на добавление ингибитора, и скорость реакции определяется скоростью диффузии субстрата. При достаточно высоких концентрэцих субстрата процесс может перейти в кине­тическую область и присутствие ингибитора становится заметным. Если же диффузия субстрата ограничена незначительно, то ингибитор будет подавлять активность иммобилизованного фер­мента. В промежуточных случаях степень ингибировання фермен­та постепенно снижается по мере того, как повышается уровень ограничений в диффузии субстрата.

Высокомолекулярные ингибиторы. Активность некоторых нто15 in vivo, в первую очередь протеаз, регулируется ингибиторами белковой природы с молекулярными массами

113

около 10 000 и выше. Естественно, их действие на иммобилизо­ванные ферменты может осложняться как диффузионными огра­ничениями, так и стерическими затруднениями. Оба этих эф­фекта будут препятствовать контакту молекулы ингибитора с ферментом и тем самым уменьшать эффективность ингибиро-взния.

Ингибирование продуктом реакции. Все рассмотренные со­ображения справедливы и для этого частного случая ингибиро-ваиия. Однако при ограничении диффузии продукта не может быть справедливым допущение о равномерном распределении ингибитора в фазах свободного раствора и носителя. Проанали­зируем, к каким кинетическим последствиям может привести этот фактор.

Во-первых, концентрация продукта-ингибитора а микроокру~ жении фермента должна быть существенно выше, чем н свобод­ном растворе. Следовательно, иммобилизованный фермент может заметно ингибироваться даже тогда, когда концентрация про­дукта во внешнем растворе мала. Во-вторых, в случае внутри-диффузионных ограничений продукта концентрация субстрата будет убывать по направлению к центру частицы, а концентрация продукта будет увеличиваться в том же направлении. Иными словами, степень ингмбирования иммобилизованного фермента, находящегося в глубине частицы носителя, будет существенно выше, чем на границе раздела с внешним раствором.

В зависимости от того, ло какому- механизму происходит ингибирование продуктом, изменяется потенциально достижимое значение максимальной скорости ферментативной реакции V. Если продукт — конкурентный ингибитор, то при высоких концентрациях субстрата удается преодолеть и ограничение диффузии, и ннгибирование продуктом (т, е. достичь значе­ния V в отсутствие ингибирования). В случае неконкурентного ннгибирования продуктом оптимальное значение скорости реак­ции {в условиях насыщения фермента субстратом) никогда не достигнет значения V. Чем эффективнее носитель препятствует свободной диффузии, тем более существенные различия в этих значениях будут наблюдаться.

Резюмируя, можно сказать, что диффузионные ограничения играют роль своеобразного кинетического буфера по отношению к экзогенному эффектору (ингибитору или активатору).

Гистерезисные н колебательные явления в катализе иммоби­лизованными ферментами. Диффузные ограничения в катализе иммобилизованными ферментами могут приводить к принципи­ально новым явлениям, не наблюдаемым ранее для ферментов в гомогенных растворах. Это гистерезисные и колебательные процессы, обнаруженные Д.Тома с сотрудниками в начале 70-х годов. Причины возникновения этих необычных явлений удобно проследить на одном частном примере — ингибированни фермен­та субстратом.

Зависимость ферментативной активности от концентрации

114

Активность, %

лнзованного фермента, подверженного ни- гнбнрованию субстратом: прямые t_f 2 и .? —зависимости скорости диффузии суб-

^стР^{ата к} Ф^еР^мен^ « [51* ч>™и- .зависимость скорости ферментативной ре- акции от концентрации субстрата в от- сутствие диффузионных ограничений; точ­ кн И. ^й. t", £>, f)—стационарные со-

^{стояния}- ^Kor«^a скорость диффузии суб- _{страта к фераденту равна скорости}

дл_я иммобилизованного фермента

с убстрата определяется дву­мя взаимосвязанными фак­торами: степенью диффузи­онных ограничений субстрата и его концентрацией в сво­бодном растворе. При этом-чем выше концентрация суб­страта н чъм ниже исходная активность фермента, тем больше вероятность, что ферментативная реакция будет протекать в кинетиче­ском режиме. Поэтому по­нятно, что увеличение кон­центрации субстрата, сопро­вождаемое снижением фер­ментативной активности {за счет ннгибнровання фермен­та), может вызвать резкий переход реакции им диффу­зионного режима в кинети­ческий.

Рассмотрим этот вывод подробнее. Согласно перво­му закону Фика скорость переноса субстрата к фер­менту прямо пропорциональ­на концентрации субстрата у поверхности носителя. Ка­тализируемая иммобилизо­ванным ферментом реакция ' достигает стационарного со­стояния, когда скорость переноса субстрата к ферменту стано­вится равной скорости его ферментативной трансформации. На рис. 22 стационарные состояния задаются точками пересечения кривой зависимости ферментативной активности от концентра­ции субстрата с прямой скорости диффузии субстрата к фер­менту. При высоких скоростях диффузии, т. е. незначительных диффузионных ограничениях (прямая 1), так и при низких ско­ростях диффузии, т. е. весьма больших диффузионных ограни­чениях {прямая 3), ня рис. 22 наблюдается лишь одна точка пересечения — одно стационарное состояние. При промежуточ­ных скоростях диффузии (прямая 2) имеется три точки Пересе-чения, т.е. допустимы три различных стационарных состояния. Если построить график зависимости реальной скорости фермен­тативной реакции от концентрации субстрата, то при высоких и низких значениях концентрации субстрата возможно только одно стационарное состояние, а при промежуточных значениях — три состояния: А, В и С. Таким образом, получаем гистерезисную

]\5

Рис. 23. Гнстереэисная зависимость реаль­ной скорости реакции для иммобилизован ного фермента, подверженного ингибирсша-нию субстратом, при диффузионных ограни­чениях субстрата от его концентрации; стрел­ки обозначено направление изменения кон­центрации субстрата [SJo в системе

кривую (рис. 23), Она означает, что скорость ферментативной реакции определяется не только концентрацией субстрата во внешнем растворе, но и зависит от направ­ления изменения концент­рации субстрата. Так, при повышении концентрации субстрата во внешнем растворе скорость фер­ментативной реакции уве­личивается. Однако при достижении некоторой критической концентрации субстрата система перехо­дит из диффузионной об­ласти в кинетическую и скорость реакции суще-ственно падает {рис. 23). При понижении концен­трации субстрата скорость реакции остается низкой до тех пор пока не произойдет обратный переход из кинетической области в диффузионную. При дальнейшем уменьшении концентра­ции субстрата скорость ферментативной реакции снова нач­нет падать.

Причины того же характера приводят к появлению внутри-мембранных колебательных процессов. В качестве одного из примеров приведем катализируемый папаином, иммобилизован­ным в искусственной мембране, гидролиз этилового эфира 1^-бензойл-и-аргинина. Один нз продуктов ферментативной реак­ции — аминокислота, накапливается в мембране (за счет ограни­чения диффузии) и тем самым с-двигает рН внутри мембраны п сто­рону более кислых значений. Это неизбежно уменьшает гидролити­ческую активность лапаина, так как фермент «выходит» из своего рН-оптимума активности. В дальнейшем за счет более быстрой диф­фузии Н⁺ по сравнению с ОЬГвозрастает значение рН внутри мем­браны и активность лапаина снова увеличивается. Таким образом, был получен микрореактор с периодом колебания 20 с. Изменением концентрации фермента в мембране, толщины мембраны и дру­гих параметров системы удается варьировать продолжитель­ность одного колебания.

Анализ условий, при которых могут наблюдаться гистерезис-иые и колебательные явления, показал, что для их возникновения необходимо» чтобы, во-первых, на зависимости скорости фермен­тативной peaк г inи от концентрации субстрата имелся максимум или точка перегиба, т, е, фермент активируется или ингибируется

субстратом или продуктом, н, fio-вторых, процесс должен быть диффузионно-контролируемым.

Аллостерические и кооперативные свойства иммобилизован­ных олигомерных ферментов. Выше были рассмотрены в основ­ном те ферменты, кинетика действия которых подчиняется урав­нению Михаэлиеа - - Ментен. Однако в природе наиболее распро­страненными являются аллостерические ферменты. Основная особенность этих ферментов состоит в том, что регуляция их активtfости под действием субстратов, продуктов н других мета­болитов клетки осуществляется по кооперативному механизму (подробно об этом явлении и его кинетическом описании см. в монографии Б. И. Курганова «Аллостерические ферменты»,

1978).

В настоящее время не вызывает сомненкя, что решающая роль в механизме кооперативной регуляции активности при­надлежит коиформационной подвижности белков. Поскольку иммобилизация иногда существенно ограничивает ее, то коопе­ративные и аллостерические свойства олигомерных ферментов в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств этих ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда умень­шается или даже совсем исчезает S-образный характер зависи­мости скорости реакции от концентрации субстрата или аллостери-ческого лиганда, Эти зависимости могут трансформироваться в сигмондальные, которые характерны для ферментов, действую­щих в соответствии с кинетическим уравнением Михазлиса — Ментен.

Иммобилизованные полиферментные системы. В последние годы получено немало доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде структурно и кинетически единых комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов, когда продукт первого "фермента является субстратом для второ­го фермента и т. д. В поли ферментных комплексах активность каждой компоненты, как правило, превышает активность изо­лированного фермента в гомогенном растворе. Основная причина этого заключается в том, что в комплексе за счет простран­ственного сближения и диффузионных ограничений могут ло­кально концентрироваться промежуточные соединения: суб­страты, активаторы, ингибиторы. Эффекта локального концентри­рования удается добиться при иммобилизации нескольких фер­ментов вместе на одном носителе.

Первая искусственная биферментная система, основанная на иммобилизованных ферментах, была создана К. Мосбахом (1970). Гексокиназу и глюкозо-6 фосфатдегидрогеназу ко-валентно присоединяли к носителю; они последовательно пере­рабатывали глюкозу в глюкозо-6-лактон-б-фосфат. По сравнению с системой двух ферментов в растворе эффективность возросла на 40— 140%; при этом исчезал индукционный период в актив­ности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (второго фермента в по­следовательности).

М7

К настоящему времени описано несколько десятков и «моби­лизационных систем, в которых согласованно действуют два, три, четыре и большее число ферментов. Все они выигрывают в эффективности по сравнению с ферментами в растворе за счет того, что вблизи активного центра второго (третьего и т. д,) фермента очень быстро достигается стационарная концентрация его субстрата.

Иммобилизованные органеллы и клетки. Иногда ферменты используют, не выделяя их из нативного микроокружения in vivo_y з в виде целых клеток или субклеточных структур — митохондрий, хлоропластов и т. п. Такая форма биокатализато­ров имеет целый ряд преимуществ. Перечислим наиболее важ­ные из них: сохранность природного микроокружения (которое, как правило, обеспечивает ферментам повышенную стабиль­ность) и способность воспроизводить ферменты природным путем при использовании варианта растущих клеток.

Для придания органеллам или клеткам большей технологич­ности их иммобилизуют. Кинетическое описание катализа под действием иммобилизованных клеток представляет очень сложную проблему. Здесь необходимо учитывать последовательную цепь диффузионных и кинетических процессов, осложненных эффек­тами распределения метаболитов и их активного транспорта (например, через биологическую мембрану). Для растущих клеток требуется также учет процессов биосинтеза и биоде­градации макромолекул. В настоящее время еще не созданы математические модели, которые бы исчерпывающе описывали кинетику действия иммобилизованных клеток, — это задача бли­жайшего будущего.

_{алБильнось}

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Во Введении отмечалось, что главное преимущество иммоби­лизованных фор мс нто Q перед свободными (несвязанными) заключается в их большей технологичности. Одним из проявле­ний этого является более высокая стабильность иммобилизован­ных ферментов по сравнению с натнвными. Дело в том, что фер­менты, как класс биологических молекул, обладают очень низкой стабильностью: стандартная свободная энергия нативнои кон-формации при обычных условиях (комнатная температура, физи­ологические значения рН, нормальное давление, определенный состав среды), как правило, лишь на 20—60 кДж/моль меньше свободной энергии денатурированной формы. Это соответствует энергии всего лишь нескольких водородных связей или одного-двух солевых мостиков и намного меньше энергии обычных кова-лентных связей, составляющих сотни кДж/моль. Поэтому даже небольших отклонений внешних условий от тех, которые харак­терны для микроокружения ферментов в клетке, может оказаться достаточно, чтобы нарушить структуру и функцию фермен­тов, т. е. нлактивировать их.

Р Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы ферменты работали при повышенных температурах» экстремаль­ных значениях рН, в присутствии высоких концентраций органи­ческих растворителей или поверхностно активных веществ и т. п. В связи с этим возникает проблема существенного увеличения стабильности ферментов.