Регенерация ферментативных систем, применяемых в биотехнологии

Ферментативные системы, применяемые в биотехнологии, имеют относительно высокую стоимость. Поэтому с экономической точки зрения было бы крайне выгодно использовать их многократно. Наиболее дорогостоящим и уязвимым компонентом любой ферментативной системы является непосредственно сам фермент. В ряде случаев в биотехнологических циклах используются ферменты, требующие для проявления своей активности кофакторы. В связи с этим проблема регенерации кофакторов также имеет немаловажное значение.

Практически сразу же после обнаружения феномена инактивации ферментов в начале XX в. стали предприниматься попытки их реактивации. К настоящему времени разработано множество достаточно эффективных подходов реактивации ферментов.

Реактивация инактивированных ферментов

Реактивация ферментов с измененной первичной структурой.

Для реактивации ферментов, утративших свою активность в результате химической модификации функциональных групп, можно использовать обратную химическую реакцию. Например, ферменты, инактивация ко­торых была вызвана окислением SH-групп, в ряде случаев удается реактивировать с помощью восстанавливающих агентов, в частности низкомолекулярных тиолов. Аналогичную стратегию можно использовать также для реактивации ферментов, потерявших каталитическую активность в результате разрушения внутримолекулярных S-S связей и образования смешанных дисульфидов. Добавление в среду тиолов приведет к расщеплению смешанного дисульфида и последующему образованию правильной S-S связи.

Реактивация ферментов, к инактивации которых привел гидролиз пептидных связей, фосфорилирование или дезамидирование остатков аспарагина, является более сложной задачей. В литературе практически отсутствуют примеры удачной реактивации подобным образом инактивированных ферментов.

Реактивация агрегированных белков. Для реактивации агрегиро­ванных белков необходимо разрушить межмолекулярные ковалентные и нековалентные контакты. Для этих целей можно использовать концен­трированные растворы мочевины и гуанидинхлорида, а также экстре­мальные значения рН.

В том случае, если при агрегации ферментов образовались межмолеку­лярные дисульфидные мостики, в среду вносят в относительно невысо­ких концентрациях (мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например, ци- стеин или дитиотрейтол). При таких концентрациях внутримолекулярные S-S связи в белке, как правило, не затрагиваются.

Десорбция фермента со стенок реакционного сосуда. Десорбция достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий между белком и сорбционными центрами на поверхности сосуда. Для этого можно использовать экстремальные значения рН, а также концентрированные растворы мочевины или гуанидинхлорида.

Реактивация необратимо денатурированных ферментов. В общем виде реактивацию таких ферментов осуществляют следующим образом. На первом этапе добиваются полного разворачивания инактивированного фермента путем разрушения всех нековалентных взаимодействий в белковой молекуле. Для этого можно использовать концентрированные растворы мочевины или гуанидинхлорида. Если в белке присутствуют S-S связи, то действие обратимых денатурантов (мочевины и гуанидинхлорида) усиливают добавлением в среду тиолов. На следующем этапе создают условия, при которых развернутый белок может свернуться в каталитически активную конформацию. В ряде случаев правильная укладка белка обеспечивается добавлением в среду так называемых эффекторов ферментативной активности - субстратов, ингибиторов и кофакторов. Данный подход был успешно использован для реактивации многих "необратимо денатурированных" ферментов.

Реактивация ферментов, инактивированных в результате десорбции кофактора из активного центра или диссоциации олигомерных белков на субъединицы. Как уже ранее отмечалось, десорбция кофактора из активного центра или диссоциация олигомерных белков на субъединицы в конечном итоге приводит к агрегации и/или химической модификации важных функциональных групп фермента. Поэтому для реактивации подобным образом инактивированных ферментов можно использовать подходы, рассмотренные выше.

Регенерация кофакторов (коферментов)

Процесс регенерации можно изобразить в виде следующей схемы:

субстрат

система регенерации

продукт

кофактор

- (коф актор)

Согласно приведенной схеме для регенерации используется система сопряженных реакций. В зависимости от типа сопряженной реакции можно выделить два способа регенерации: ферментативный и неферментативный. К ферментативным относятся методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов. Неферментативные способы регенерации включают в себя химические и электрохимические подходы.

Ферментативный способ