Метод определения фосфатазы по реакции с 4-аминоантипирином

Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфарной кислоты ферментной фосфатазой, содержащимся в молоке и молочных продуктах. Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присутствии окислителя дает розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Приборы: Весы лабораторные рычажные 2 класса точности (наибольший предел взвешивания 200 г), пробирки стеклянные, пипетки вместимостью 5 мл, ступка фарфоровая с пестиком, колба коническая на 100 мл, цилиндр стеклянный вместимостью 25 мл.

Реактивы: Х.ч. хлорид аммония, 25 %-ный ч.д.а. раствор аммиака, динатриевая соль фенилфосфорной кислоты (двуводная), 4-аминоантипирин, х.ч. сульфат цинка, х.ч. сульфат меди, эфир этиловый, вода дистиллированная.

Ход анализа

К 3 мл молока или сливок добавляют 2 мл рабочего раствора субстрата. Затем содержимое пробирки перемешивают и ставят в водяную баню температурой 40-45⁰ С на 30 мин. После подогревания в водяной бане в пробирку добавляют 5 мл. осадителя системы цинк-медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова ставят в водяную баню температурой 40-45⁰С. Вынув пробирку из бани, сравнивают содержимое пробирки с контролем. Контролем является аналогичная реакция с кипяченым молоком. Если в опыте с кипяченым молоком появляется слабо-розовое окрашивание, то соль подлежит дополнительной очистке.

При отсутствии фермента фосфатазы в молоке или сливках содержимое пробирки (раствор, отделившийся от осажденного белка) бесцветное, т.е. такое же, как содержимое пробирок контрольного опыта. Следовательно, молоко (сливки) было пропастеризовано.

При наличие фосфатазы в молоке или сливках содержимое пробирок (раствор) окрашивается от розового до темно-красного цвета. Следовательно, молоко (сливки) не подвергалось пастеризации или подвергалось пастеризации при температуре ниже 63⁰С, или было смешано с не пастеризованным молоком (сливками). При оценки результатов реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не пастеризованного молока или сливок к пастеризованному в количестве 0,3%.

Определение фосфатазы по реакции с фенолфталеинфосфатом натрия (ускоренный метод)

Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия ферментом фосфатазой. Освобождающийся при гидролизе фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание.

Посуда: пробирки стеклянные из бесцветного стекла с нанесенными метками на 2 мл, пипетки на 1 и 2 мл. пробирки резиновые.

Реактивы: Ч.д.а. 1н раствор аммиака, х.ч. или ч.д.а. 1н раствор хлорида аммония ( NH₄Cl ), смесь буферная аммиачная, фенолфталеинфосфат натрия порощкообразный 10 или 0,1 % раствор, вода дистиллированная.

Ход анализа

В пробирку отмеривают 2 мл молока или сливок и 1 мл раствора фенолфталеин фосфата натрия. После добавления реактива пробирку закрывают пробкой и содержимое взбалтывают. Затем пробирку помещают в водяную баню температурой от 40 до 45⁰С и определяют окраску содержимого через 20 мин. выдержки через 1 ч.

При отсутствии фермента фосфатазы в молоке или сливках окраска содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, молоко или сливки подвергались пастеризации. При наличие фосфатазы в молоке или сливках содержимое приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой, Следовательно, молоко или сливки не подвергались или подвергались пастеризации при температуре ниже 63⁰С, или были смешаны с непастеризованными продуктами.

Чувствительность метода обнаружить добавлением менее 2 % непастеризованного продукта к пастеризованному.