Разностная (дифференциальная ) спектрофотометрия
При работе с биологическими объектами часто бывает необходимым выявлять относительно небольшие изменения в оптической плотности объекта на фоне неизменного и сильного общего поглощения света в нем. Для решения этой задачи широко применяется метод разностной спектрофотометрии.Суть этого метода состоит в том, что на спектрофотометре измеряется не абсолютная оптическая плотность исследуемого образца (Dи), а разность (Dр) между оптической плотностью стандартного образца (Dст) иDи, причем исследуемый образец получают из стандартного, оказывая на него специфическое модифицирующее воздействие (например, окисляя или восстанавливая определенные хромофорные группы, меняя их заряд и т.д.).
Задание работы
Методом разностной спектрофотометрии показать исчезновение характерной полосы поглощения при 550 нм перманганата калия при его окислении тиосульфитом натрия. Поскольку метод разностной спектрофотометрии (см. выше) не требует регистрации производных, все измерения при выполнении этого задания проводятся только в режиме «D». Для получения разностного спектра необходимо сначала зарегистрировать «нулевую» линию – спектр, отражающий различия в толщинах кювет и концентраций перманганата калия в кюветах с «образцом» и «контролем». Для этого в обе кюветы помещается одинаковый водный раствор перманганата, и производится регистрация спектра поглощения в спектральном диапазоне 460-610 нм. Полученный спектрне должен представлять из себя идеальную прямую – это означает, что прибор не регистрирует различий в оптической плотности, каковые всегда имеются из-за небольших различий в толщине кювет и концентраций растворов у опытного и контрольного объектов. После регистрации «нулевой» линии непосредственно в «контрольную» кювету вводятся 1-2 кристаллика тиосульфита натрия, полностью растворяются в ней, и запись спектра повторяется. При правильном выполнении задания при повторной регистрации спектра на нем появляется ранее отсутствовавшая полоса поглощения при 540 нм. В окончательном виде разностный спектр вычисляется путем вычитания из последнего измеренного спектра «нулевой» линии.
Отчет и выводы
В отчете по работе должны содержаться:
Спектр поглощения оксигемоглобина, первая и вторая производные этого спектра.
Спектр поглощения водного раствора KMnO4, первая и вторая производные этого спектра.
Разностный спектр поглощения окисленной и восстановленной форм KMnO4.
Зависимости амплитуд максимумов и минимумов на D’=f() как функции тангенсов угла наклона касательных к зависимостиD=f() в точках перегибов (т.е. в точках максимумов и минимумов на производной).
Величины констант пропорциональности между истинным и измеряемым значениями производных.
Величины полуширин полос поглощения на спектрах оксигемоглобина и KMnO4и их вторых производных с указанием соотношений этих полуширин.
В выводах обсуждается следующее:
Какой метод регистрации производных спектров поглощения используется в данной работе? Обосновать заключение полученными результатами.
Приводит ли регистрация второй производной спектра поглощения к увеличению разрешения полос поглощения? Почему? Во сколько раз в среднем падает полуширина полос поглощения на второй производной спектра в сравнении с ее исходным значением?
Позволяет ли регистрация разностного спектра увидеть ранее отсутствовавшие максимумы поглощения? При какой длине волны расположен в Вашем случае этот максимум?
Отчет должен содержать следующее:
Название работы
Краткое теоретическое введениес описанием биофизических основ применяемых при выполнении методов.
Подробное описание хода проведения измерений и обсчета данных(включающее в себя описания всех проводившихся черновых расчетов, их промежуточные и конечные результаты).
Полученные окончательные результаты(преимущественно в виде таблиц и графиков, оформляемых в соответствии с требованиями журнала «Биофизика»).
Выводы с элементом обсуждения, в которых не просто констатируется факт получения того или иного результата, но и объясняются связи между полученными данными и общими закономерностями, приведшими к их получению.