Uchebnik

Ворганизме человека и животных витамины А1 и А2 участвуют в окислительно-восстановительных превращениях с участием фермента каротиназы, в частности в формировании и питании сетчатки глаз, улучшая зрение.

Каротиноиды в растениях выполняют роль переносчиков кислорода и имеют множество кислородсодержащих производных (ксантофиллов), основными физиологическими свойствами которых являются иммуномодулирующее, рострегулирующее, антиоксидантное.

Каротиноиды отличаются температурой плавления, легко растворимы в хлороформе, бензоле, мало растворимы в петролейном эфире, практически не растворимы в спирте, что используется при их извлечении из растений и отделении от сопутствующих веществ.

Вчастности, максимальное извлечение каротиноидов из растительного сырья достигается последовательной экстракцией разнополярными растворителями, поскольку в неполярные растворители переходят агликоны многих групп БАВ и жировые кислоты.

Например, измельченное сырье обрабатывают в гомогенизаторе ацетоном. Процесс экстракции повторяют до получения бесцветных экстрактов, затем их объединяют, добавляют 10% раствор натрия хлорида и интенсивно встряхивают с эфиром для перевода каротиноидов в эфирный слой. После расслоения фаз эфирный слой сушат трехкратной обработкой безводным натрия сульфатом. Для удаления жирных кислот, перешедших в эфирную фракцию, проводят омыление раствора действием 10% раствора калия гидроксида в спирте метиловом. После этого каротиноиды переводят в эфирный слой.

Достаточно селективным может также считаться выделение суммы каротиноидов экстракцией тетрагидрофураном, содержащим 0.1% бензилбутилового эфира в присутствии безводного натрия сульфата (20% от веса

растения). Полученный экстракт подвергают ультразвуковому воздействию при температуре 5-100С, концентрируют досуха в мягких условиях (вакуум водоструйного насоса, температура не выше 400С), концентрат растворяют в гексане и анализируют методом ВЭЖХ. Эффективного разделения суммы каротиноидов методом ВЭЖХ можно достичь на колонке Spherisorb ODS-2, с использованием смеси ацетон-вода (3:7) в качестве подвижной фазы и фотодиодного детектора. Аналогичная подвижная фаза с градиентом концентрации ацетон/вода от (86:14) до (97:3) была использована при

разделении стереоизомеров каротиноидов на колонке Prontosil C30 при длине волны детектора 450 нм. Хорошие результаты были получены на YMC C30 колонке, подвижной фазой служила смесь: метанол-вода-метил-трет- бутиловый эфир, с градиентом концентрации от (90:5:5) за 12 мин до (95:0:5), от (95:0:5) до (75:0:25) за 30 мин и фотодиодный детектор (250-540 нм).

Использование колонки с µBondapack C18 позволило провести препаративное выделение каротиноидов перца. Эффективными для разделения оказались подвижные фазы: ацетонитрил-метанол (7:3) и ацетонитрил-вода (4:6) с добавлением 1% уксусной кислоты. В работе использовался УФ детектор (280

и450 нм). C18 колонка с SphereClone ODS сорбентом оказалась эффективной в

201

исследовании каротиноидов при использовании градиента подвижной фазы А: ацетонитрил-вода (9:1) и В: этилацетат от (10:90) до (35:65) за 25 минут.

Основными подвижными фазами, используемыми при разделении и препаративном выделении каротиноидов в тонком слое, являются:

1петролейный эфир (65-950С) ацетон-диэтиламин (10:4:1)

2диэтиловый эфир – гексан (60:40)

3гексан-метанол-тетрагидрофуран (75:20:5)

4гексан – метанол (8:2)

Качественное обнаружение каротиноидов возможно реакциями:

Реакция Карра-Прайса. Добавляют 2 мл насыщенного раствора

сурьмы хлорида в хлороформе, появляется зеленовато-синее (λmax 590 нм) окрашивание, быстро переходящее в бурое.

Добавляют 2-3 мл 1% раствора калия перманганата или бромной воды, при встряхивании происходит обесцвечивание раствора.

Добавляют 4-5 капель 10% спиртового раствора кислоты фосфорномолибденовой, появляется синее окрашивание (эту реакцию можно наблюдать

ипри БХ и ТСХ, синие пятна на желто-зеленом фоне).

Извлечение петролейным эфиром поглощает в УФ-свете (400-410 нм).

Химические свойства каротиноидов

Часть химических реакций описана выше на структурах конкретных каротиноидов (ликопин, кератины, витамин А). Основной структурной особенностью каротиноидов является наличие длинной сопряженной системы π- связей.

Для эффекта сопряжения характерно увеличение числа р-компонент в сопряженной системе, что сопровождается синхронным повышением верхней занятой МО и понижением нижней свободной МО:

В плане электронного строения каротиноиды характеризуются высокой степенью электронодонорности (легко отдают электроны) и высокой степенью электроноакцепторности (легко принимают электроны). Отсюда вытекают

202

такие свойства каротиноидов как легкость окисления и восстановления, их способность поглощать фотоны малой и средней энергии (т.е. видимый и ультрафиолетовый свет) и, соответственно, быть окрашенными соединениями. Из этих же свойств вытекают и биологические функции каротиноидов в растениях: во-первых – участие в процессах фотосинтеза, так как этот процесс включает стадии поглощения света и переноса электрона; во-вторых – светозащитные свойства, связанные со способностью поглощать световую энергию без существенных изменений структуры молекулы каротиноида.

Также очень важна реакция окисления каротиноидов тех структур, которые содержат циклогексановый фрагмент с сопряженной двойной связью (например, β-каротин), ведущая к образованию витамина А. Реакция проходит по центральной связи С=С с образованием циклического пероксида в качестве промежуточного соединения:

Чистые каротиноиды легко окисляются на свету и на воздухе при стоянии растворов, с чем связано изменение их цвета.

При использовании растворов калия перманганата, окисление возможно не только с образованием пероксидов. Промежуточными довольно устойчивыми и оптически активными являются полигликоли, с образованием которых связывают повышение биодоступности таких молекул и действие на желудочно-кишечный тракт (обволакивающее, противовоспалительное):

Аналогично витамину А, гликоли при наличии С=С связей могут быть цис-транс конфигурации и благодаря этому связываться с белковыми молекулами по типу гликоновых оснований с выделением молекул воды, за счет донорно-акцепторного, кислотно-основного взаимодействий или за счет межмолекулярных водородных связей.

Структуры всех каротиноидов устанавливаются комплексом химической информации, получаемой из реакций:

реакции окисления (качественно подтверждается наличие С=С-связей; дозированное количество О2 подтверждает число связей С=С);

реакции восстановления (также являются качественным и, особенно количественным показателем);

получение – OR и ацилированных производных подтверждает наличие и количество ОН – групп.

203

Однако, эти методы не подтверждают расположение С=С- связей, ОН, С=О и других функциональных групп и наличие в структурах каротиноидов карбоциклов, их числа и степень их ненасыщенности.

Поэтому, помимо химических реакций, указанных выше, для установления строения каротиноидов используют спектральные методы, из которых наиболее информативными являются 13С-ЯMР, масс-спектрометрия и рентгеноструктурный. В ПМР-спектрах наблюдается наложение сигналов резонанса -СН и =СН, что затрудняет их интерпретацию. 13С-ЯMР-спектры отражают число углеродных атомов в целом, а возможные наложения сигналов эквивалентных атомов проверяют методом двойного резонанса. Масс-спектры дают слабоинтенсивный сигнал, соответствующий молекулярной массе и характеристичный путь фрагментации, в зависимости от строения молекул.

Тонкая структура и пространственные эффекты устанавливаются сопоставлением 13С-ЯMР-спектров и рентгеноструктурным анализом с измерениями длин связей и углов между атомами.

Филзер на основе анализа большого числа полиеновых систем вывел уравнение для вычисления максимумов поглощения каротиноидов:

λmax (гексан) = 114+5М+n(48.0-1.7n)-16.5R1-10R2

где М - число алкильных заместителей, n - число двойных связей, R1 и R2 - число колец, содержащих соответственно эндо- и экзоциклическую двойную связь, С=О. Так λmax полностью транс-ликопина равен 476 нм совпадает с вычисленным значением (474 нм), для β-каротина (М=10, n=11, R1 =2, R2=0).

λmax= 114+5· 10+11 (48.0-1.7·11)- 16·5·2 = 453 нм (эксп. 451 нм)

Метод ПМР дает информацию о различном характере групп СН3 в зависимости от их расположения. Интенсивный синглет в сильном поле (1.01 м.д.) обусловлен гем-диметильной группировкой, тогда как другие резонируют в области 1.69-1.90 м.д. Поглощение олефиновых протонов в области 5.88-6.55 м.д. и дублет при 7.39 м.д. указывает на транс их расположение.

В природном метиловом эфире биксина олефиновая система прописывается при 5.88, 7.37 и 7.93 м.д., что может соответствовать 4-цис- изомеру вследствие различного экранирования β-протонов и выводу о том, что биксин является 16 цис-изомером:

Стероиды

Стероиды животного и растительного происхождения – это полициклические политерпены, чаще содержащие 4 карбоцикла и различные функциональные группы. Гидроксилсодержащие стероиды называют стеринами (фитостеринами), самый изученный, из которых содержится во всех органах животных, в мозге, в нервных тканях, желчных камнях – холестерин. В спорынье содержится эргостерин, в соевых бобах –

204

стигмастерин, которые хорошо растворимы в хлороформе. Большинство стероидов оптически активны и существуют в виде «n» числа изомеров:

К стероидам относятся половые гормоны, гормоны коры надпочечников, стерины, желчные кислоты, сапогенины, сердечные агликоны, некоторые алкалоиды и т.д.

Стерины растений образуют в кишечнике нерастворимые комплексы с желчными кислотами, препятствующие ресорбции холестерина и снижающие, таким образом, его содержание в крови на 20%. На этом основано терапевтическое применение, например, β-ситостерола при лечении тяжелых форм гиперлипидемии и гиперхолестеринемии. Также ситостерол широко используется в мировой фармацевтической промышленности в качестве сырья в синтезе стероидных гормонов и как лекарственное средство для лечения болезней предстательной железы.

Многие стеролы, в том числе эргостерол, проявляют антимикобактериальную активность против Мусоbасterium Tuberculosis. Это соединение описано в растениях кермек Гмелина и кермек Попова:

Общее название стерины произошло от греческого steros – твердый, поскольку вторичные спирты состава С21-С29 животного или растительного происхождения являются кристаллическими веществами с четкими температурами плавления, как правило, от 100 до 2000С.

Ситостерины (греч. sito - зерно) – наиболее распространенные растительные стерины, содержат скелет 5-енолов-3β с радикалом С2Н5 у С24 и отличаются конфигурацией С20 и С24.

Спинастерины (шпинат, люцерна, пшеница, млечный корень и др.) имеют группу С2Н5 у С24 и С22=С23, другие ненасыщенные связи могут быть у С7 ( 7- стерин, 7-стигмастенол), 5,11, 7,11 (стигмастерины), 8(14) (зимостерины).

205

Стерины зеленых водорослей представлены суммой ситостеринов, в бурых водорослях доминирует фукостерин (С29Н48О), 5,24(28)-стигмастандиенол-3β и изомерный стерин - саргастерин, 20-эпимер фукостерина и брассикастерин - 24β-метильное производное из растений и моллюсков.

Во многих растениях и грибах, а также в латексах, спутником пентациклических тритерпенов является ланостерин, представитель метилстеринов, большое разнообразие которых отмечено в шерстяном жире:

Циклоэвкаленол из Eucalyptus microcorys, эйфол из Euphorbia,

бутироспермол из масла орехов Butyrospermum, тирукаллол и эйфорбол из смол нескольких видов молочая также являются представителями метилстеринов и отличаются числом и расположением двойных С=С связей:

При исследовании неомыляемой фракции масла из корки грейпфрута, описаны β-ситостерин, фриделин и цитростадиенол, относящиеся к группе 4- метилстеринов.

Холестерин до шестидесятых годов прошлого столетия считавшийся животным стеролом, обнаружен и в растениях, но в незначительных количествах; растения рода Sоlаnасеае и красные водоросли продуцируют холестерол.

Ниже приведены наиболее употребляемые качественные реакции с хлороформными экстрактами:

Реакция Сальковского. Добавляют 1 мл серной кислоты концентрированной, появляется окрашивание на границе фаз от желтого до кроваво-красного (холестерин - красное окрашивание).

Реакция Либермана-Бурхарда. К раствору стерина добавляют 1 мл уксусного ангидрида и несколько капель кислоты серной, появляется синезеленое окрашивание (стеролы).

Реакция Розенхейма. Добавляют 1 мл трихлоруксусной кислоты в хлороформе, появляется красное окрашивание (система сопряженных С=С

связей).

206

 Реакция Тортелли-Жаффе. Добаляют раствор брома в хлороформе и уксусную кислоту, появляется сине-зеленое окрашивание (присутствие в кольце С=С связей).

 Реакция Петтенкофера. Добавляют 1 мл фурфурола в концентрированной кислоте серной; стероиды дают синее или красное окрашивание.

 Реакция с дигитонином позволяет отличить 3β- и 3α-оксистеролы. Комплексные аддукты образует только 3β-оксистерол.

 Реакция Карра-Прайса. Добавляют 2 мл 30% раствора сурьмы хлорида (III) в хлороформе или тетрахлорэтане, появляется синее окрашивание

(холестановые производные с ди- и триеновыми кольцами). Кетохолестерил-

ацетат этой реакции не дает.

 Реакция Физера. Добавляют 3 мл толуола, нагревают до 1000С, добавляют 3 мл 0.1М раствора SeO2; желтое окрашивание через 10-15 минут меняется до красного (5αили 5-стероиды, с двойной связью рядом с С14).

Реакция Каленберга. Добавляют 1 мл 30% раствора сурьмы хлорида

(V)в хлороформе, появляется различное яркое окрашивание (тритерпеноиды и стероиды).

Реакция Чугаева. Добавляют 2 мл раствора цинка хлорида, 1 мл хлорангидрида уксусной кислоты в хлороформе; выпадает осадок или появляется окрашивание (стероиды и тритерпеноиды).

Реакция Портера-Зильбера. Добавляют 1 мл метанола, 8 мл фенил-

гидразина в кислоте серной (65 мг в 100 мл разбавленной кислоты серной (31:19)); появляется желтое окрашивание или осадок (17,21-диокси-20-

кетостероиды).

Реакция Дише. Добавляют 5 мл кислоты уксусной, 2 мл кислоты серной, 2 мл раствора дифениламина (0.6 г в 10 мл Н2О), нагревают до 1000С, появляется зеленое или фиолетовое окрашивание (стероиды с α-кетогруппой в боковой цепи).

Реакция Ноллера. Добавляют SnCl3, FeCl3 или SbCl3 и 1 каплю тионилхлорида; появляется окрашивание или осадок (тритерпеноиды в отличие от стероидов).

Химические свойства стероидов

 При расщеплении стероидов были получены продукты, аналогичные продуктам распада холестерина. Это свидетельствует о том, что конфигурации С8, 9, 10 и 13 во всех стероидах и конфигурации центров 14 и 17 являются идентичными. Абсолютная конфигурация стероидов доказана методом корреляции конфигурации С20 и глицеринового альдегида, а относительная конфигурация заместителей - с помощью реакций циклизации. Так, трансрасположение 3-ОН и S-Н в дигидрохолестерине (холестеноле) доказывается лактонизацией дикарбоновой кислоты, образующейся при окислении холестанола и подтверждает β-конфигурацию 3-ОН-группы:

207

Скелеты стероидных молекул и тритерпены пригодны для конформационного анализа, так как состоят из конденсированных циклогексановых колец, сочлененных в транс-положении в форме кресла.

 3-ОН-группа легче других вступает в реакции алкилирования, ацилирования и гликозидирования:

 В структуре холевой кислоты три ОН-группы, но 3-ОН легче других участвует в химической трансформации:

208

Разработаны реакции избирательного ацетилирования первичных и вторичных ОН-групп, омыление ацетатов 0.1% метанольным раствором гидроксида калия (натрия) при комнатной температуре и при нагревании.

В растениях описаны и стероидные алкалоиды (соласодин) и пентациклический тритерпеноид – глицирретовая кислота, которые явились объектами изучения их реакцеспособности и химической трансформации.

Соласодин является исходным в синтезе гормональных препаратов, синтезом пиразольных и изоксазольных циклов по кольцам А и D стероидных молекул:

 На основе стероидов соласодина и диосгенина получены производные спироаминосоланов и проведена фармоценка полученных соединений:

R1	N					R1 N
											N
	O						OH		+		R1
											OH
R R= OH; R1= H; 5			R		R=R = H;		5 R
R=R1= H; 3,5					1
					R=R =COCH ; 5
					1		3			3,5
					R= H; R = COCH ;
					1				3
R	N				R1
					O					R1
									NH2OH
										N
	O				HO						O
								R1
						R"NH-NH2			N N
O

R"

209

Методом дифракционного оптического вращения определены конфигурации производных 5αН и 5βН-соласодинов, диосгенинов и эпимеров глицирретовой кислоты:

 Глицирретовая кислота содержит сопряженную С=О-группу и широко используется в синтезах биологически активных соединений, в том числе, аналогичных описанным выше:

Конденсацией 3-кетона с п-анизилгидразинами получены 5’-замещенные тритерпеновые индолы. На основе 3-кетометилглицеррата осуществлены синтезы хинолиновых соединений. Кроме того, 3-кетостероиды легко реагируют с о-аминобензальдегидом, изатином и антраниловой кислотой с образованием хинолиностероидов, например:

O

H

H2N

N

[O]

N

+

O

- H2O

H O

HO

O

NH2NH2

H2

NH3

ROH

NH2OH

H2

NH3

ROH

NH2OH

H

NH

ROH

Na

PCl5

2

3

Экдистероиды описаны из левзеи, больше их содержится в листьях, меньше - в корнях. Наряду с известными β-ситостерином, его гликозидом С-29 экдистероидом (алларастерон А) выделены и идентифицированы новые С-29 экдистероид с аллильной ОН-группой, названный расепстероном и 25-

эпиамарастерон А, структуры которых доказаны УФ-, ИК-, масс-, 1Н, 13С-ЯМР, 1Н-1Н и 1Н-13С- СОSY.

210