Лекция_3_ГИ_М_2014

ПЦР

ПЦР

LB Prom селективный Ter	Prom целевой	Ter	RB
ген	ген	ter

Доказательство присутствия в геномной ДНК растений последовательностей целевого гена и гена селективного маркера

ü

VirE	гены вирулентности A. tumefaciens штамма AGLO
VirD1

ü

гены «домашнего хозяйства»

Act	- ген актина

NtGA2 - ген, кодирующий α–субъединицу GTP-связывающего белка табака

ü

LB	P-nos	nptII	T-nos P-35S целевой	LicB T-ocs RB
			ген	ter
		bar

DesA - ген, кодирующий -12 десатуразу

DesC - ген, кодирующий -9 десатуразу

Ген/ регуляторный элемент					Размер амплифицируемого
					продукта, п.н.
					табак	картофель
DesA	ген, кодирующий		-12 десатуразу		949	949
DesC	ген, кодирующий		-9 десатуразу		777	777
LicB	ген,	кодирующий	термостабильную		632,	369,
	b-1,3-1,4-глюканазу (лихеназу)				291	291
nptII	ген,	кодирующий		неомицин	473	473
	фосфотрансферазу
NtGA2	ген, кодирующий α–субъединицу				609	-
	GTP-связывающего белка табака
Act	ген актина				500	600
virE	ген	вирулентности A.		tumefaciens	600	600
	штамма AGLO
P-35S	промотор 35S РНК CaMV				382	382

Праймеры подбираем таким образом,

чтобы размеры амплифицируемых фрагментов можно было разделить и различить

п.н.

1500

1000

700

500

400

200

M desA desC LicB nptII T-nos VirE

act NtGA2 M

Праймеры подбираем таким образом, чтобы размеры амплифицируемых фрагментов

можно было разделить и различить

т

р

а

н

с

фdesC

о777 п.о.

р

м

а

н

т

к

о

н

т

р

о

л

ь Подбираем температуру таким образом, чтобы не было не

специфики

Проблемы, которые могут быть!!!

nptII

п.н.

1500

1000

700

500

300

M v K T1 T2 w v K T1 T2 w

v K T1 T2

М – маркер молекулярного веса, v – экспрессионный вектор; T1, T2 – независимые линии первичных трансформантов; К – контрольное

растение; w – отрицательный контроль (вместо проб ДНК использован буфер).

LB	P-nos	nptII	T-nos P-35S целевой	LicB T-ocs RB
			ген	ter
		bar