Лекция_3_ГИ_М_2014
.pdf
|
|
|
Размер амплифицируемого |
||
Ген/ регуляторный элемент |
продукта, п.н. |
||||
табак |
картофель |
||||
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
DesA |
ген, кодирующий |
-12 десатуразу |
949 |
949 |
|
DesC |
ген, кодирующий |
-9 десатураза |
777 |
777 |
|
LicB |
ген, кодирующий |
термостабильную |
632, |
382, |
|
|
b-1,3-1,4-глюканазу (лихеназу) |
291 |
291 |
||
NtGA |
ген, кодирующий α–субъединицу |
609 |
- |
||
GTP-связывающего белка табака |
|
|
|||
Act |
ген актина |
|
500 |
600 |
|
|
|
|
|
||
virE |
ген вирулентности A. tumefaciens |
600 |
600 |
||
|
штамма AGLO |
|
|
|
|
T-nos |
терминатор нопалинсинтазы |
188 |
188 |
||
|
|
|
|
||
P-35S |
промотор 35S РНК CaMV |
382 |
382 |
||
|
|
|
|
|
|
act
licB
Tnos
независимые трансформанты
+ – образец агробактериальной ДНК штамма AGLO, К – контрольное растение; Н2О – отрицательный контроль (вместо проб ДНК использована вода).
Картофель desA-licB
desA
virE licB
act
T-nos
desA LicB
act
T-nos
М w v T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 K M
|
М – маркер молекулярного веса, |
|
w – отрицательный контроль (вместо |
|
проб ДНК использован буфер), |
|
v – экспрессионный вектор, |
|
T1-T12 – независимые линии |
|
первичных трансформантов, |
М v |
К – контрольное растение. |
Т10 Т11 Т12 w |
NTGA2
(ген домашнего
хозяйства)
virE virD1
ПЦР
(качество препарата ДНК)
ПЦР
(агробактериальная контаминация)
Область T-ДНК инсерции в геномную ДНК растения
Pnos nptII |
Tnos p35S desA |
licBM3 |
polyA |
ПЦР |
ПЦР |
ПЦР |
(селективный ген) |
(целевой ген) |
(репортерный ген) |
Система праймеров, их соотношения и условия проведения мультиплексной ПЦР разработаны на коллекции модельных трансгенных растений:
üNicotiana tabacum L.
üArabidopsis thaliana (L.) Heynh
иуспешно апробированы на трансформантах сельскохозяйственно-важных культур:
ü картофель
üсвекла
üтоматы
üсалат
Определение количества копий трансгена
Определение количества копий трансгена
|
BamHI |
|
|
PvuII |
SalI |
HindIII |
XbaI PvuII |
|
Pnos |
nptII |
pA P35SCaMV Лидер Ген Х |
У |
pA |
|
BamHI |
|
|
PvuII |
SalI |
HindIII |
XbaI PvuII |
|
Pnos |
nptII |
pA P35SCaMV Лидер Ген Х |
У |
pA |
Гидролиз геномной ДНК трансгена и контроля эндонуклеазой рестрикции BamHI
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
|
BamHI |
BamHI |
BamHI |
|
|
BamHI |
|
|
PvuII |
SalI |
HindIII |
XbaI PvuII |
|
Pnos |
nptII |
pA P35SCaMV Лидер Ген Х |
У |
pA |
Гидролиз геномной ДНК трансгена и контроля
эндонуклеазой рестрикции BamHI
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
|
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
BamHI |
|
|
Количество копий трансгена
Блот-гибридизация по Саузерну
Обнаружено 1-2 инсерции целевого гена
Почему нужно и важно определять число копий