Лекция_3_ГИ_М_2014

Определение числа копий трансгена при самоопылении

Т-ДНК

Т0

Т1

3K+m: 1K-m

Определение целостности интегрированной последовательности трансгена

	BamHI
PvuII	SalI	HindIII	XbaI PvuII

Pnos

nptII

pA P35SCaMV Лидер Ген Х

У

pA

Гидролиз геномной ДНК трансгена и контроля

эндонуклеазами рестрикции SalI и XbaI

SalI	XbaI
Лидер Ген Х	У

3500 п.н. или 4400 п.н

Гибридизация по Саузерну геномной ДНК контрольного и трансгенных растений табака

у всех линий трансгенных растений произошла встройка в геном одной копии

гибридного гена

п.о

.

п.о

.

размеры перенесенных в геном растений последовательностей перенесенных генов полностью соответствуют размерам

Концепция «лимитирующего звена» в приложении к процессу экспрессии

Высокий уровень экспрессии

Транскрипция	Процессинг	Трансляция	Стабильность

Низкий уровень экспрессии

ДНК	пре-	мРНК	Белок
	мРНК

Низкий уровень экспрессии (	- низкоэффективные
стадии)

Методы анализа экспрессии трансгена на уровне синтеза мРНК

1.Нозерн-блот гидридизация

2.Полуколичественный метод ПЦР с обратной транскрипцией

3.ПЦР в реальном времени – точная количественная оценка уровня экспрессии гена (определяем количество мРНК, т.е. уровень транскрипции целевого гена)

Нозерн-блот гибридизация

1.Этап – разделение препаратов мРНК в агарозном геле

2.Этап – перенос разделенных молекул на мембрану

(фиксация количества и положения)

Нозерн-блот гибридизация

3. Этап – мечение ДНК пробу (часть последовательности целевого гена) и последующая детекция

4.Анализ полученных результатов

К1 2 3 4 5

GOIs

HKG

Анализ экспрессии трансгена методом

RT-PCR

•Оценивается синтез матричной РНК - транскрипция

Анализ экспрессии трансгена методом

RT-PCR

•Синтез матричной РНК выявлен у:

К+	К-	52%
914 п.н.		Образцов 1 линии

	К+	60%
		Образцов 2 линии
	914 п.н.

1. Этап – определяем а есть ли вообще транскрипция914 п.н. целевого гена?

107 п.н.

Анализ экспрессии трансгена методом

RT-PCR

•Оценивается эффективность синтеза матричной РНК - транскрипция

Высокий уровень транскрипции – 100 молекул мРНК Средний уровень транскрипции – 10 молекул мРНК Низкий уровень транскрипции – 1 молекула мРНК

Первое трансгенное растений – высокий уровень	100 молекул мРНК
Второе трансгенное растений – средний уровень	10 молекул мРНК
Третье трансгенное растение – низкий уровень	1 молекула мРНК

914 п.н.

107 п.н.