Занятие 2 Тема: Выделение белков, фракционирование и их гидролиз.

Цель: Получить представление о методах выделения белков из биологических материалов, о возможностях их фракционирования и гидролиза.

Материальное обеспечение:

Продукты: яичный белок - 1% раствор; желатин - 1% раствор; молоко.

Реактивы: сульфат аммония - кристаллический; сульфат аммония - насыщенный раствор, гидроксид натрия - 10%-ный раствор, сульфат меди - 1%-ный раствор; соляная кислота - 1% раствор; этиловый спирт; азотная кислота конц.; индикаторная бумажка (универсальная, лакмус); СН₃СООNa - 0,1Н; СН₃СООН - 0,1Н; СН₃СООН - 1Н; дистиллированная вода.

Посуда и оборудование: пробирки; пробирки с обратным холодильником; воронки; складчатые фильтры; стеклянные палочки; пипетки; химический стакан - 50 см³; цилиндры -10 см³.; песчаная баня; спички; держатель для пробирок.

Методические указания

Выделение белков из биологического материала начинается с извлечения их соответствующим растворителем (экстракции). Каждый белок обладает определенной растворимостью, зависящей от природы самого белка и состава растворителя. Белки бывают водорастворимыми (гистоны, альбумины), солерастворимыми (протамины, глобулины), растворимыми в слабощелочных (глютелины) и водно-спиртовых растворах. (проламины ). На растворимость существенное влияние оказывает рН среды.

Из полученных экстрактов белки, исходя из их свойств, разделяют или фракционируют различными методами:

1. Электрофоретические - основаны на разделении белков в постоянном электрическом поле в зависимости от величины заряда белковой молекулы.

2. Ультрацентрифугирование - основано на различной скорости седиментации отдельных белков в зависимости от их молекулярной массы.

3. Хроматографические:

а) ионнообменная хроматография - основана на различной способности отдельных белков к обмену с ионами ионнообменных смол;

б) на молекулярных ситах (гель-фильтрация) - на сефадексах - белки разделяются в зависимости от величины молекулы;

в) аффинная хроматография - белки делятся на индивидуальные в зависимости от средства к аффинату (наполнителю колонок)

4. Высаливание - чаще с помощью сернокислого аммония - основано на снятии заряда и водной оболочки различными концентрациями солей. Это старый метод разделения белков.

5. Аминокислотный состав белков определяют в аминокислотном анализаторе после проведения их гидролиза.

Опыт 1. Выделение казеина из коровьего молока.

Молоко - идеальный продукт, содержащий почти полный набор природных веществ, необходимых для питания: белки, липиды, углеводы, витамины, минеральные соли и др.

Особую ценность имеют белки молока: казеин, лактоальбумин, лактоглобулин, липопротеиды, белки-ферменты и др. Основной белок коровьего молока - казеин - является фосфопротеидом. На его долю приходится около 80% белкового азота молока. Казеин присутствует в молоке в виде растворимой кальциевой соли (казеиноген). Он неоднороден и состоит из нескольких индивидуальных белков (-, -, - и К-казеин), отличающихся по аминокислотному составу и содержанию фосфора.

Казеин молока выделяется с помощью ферментов химозина и пепсина или в кислой среде при рН 4,6 - 4,8 (изоэлектрическая точка казеина) в виде мягкого, медленно оседающего осадка.

Ход работы:

В химический стакан вместимостью 50 см³ отмерить мерным цилиндром 3 см³ молока и добавить 7 см³ дистиллированной воды. Смесь перемешать и добавить 10-15 капель 1%-ного раствора НСI. Кислоту приливать аккуратно, так как в избытке кислоты осадок казеина растворяется. Суспензию очень осторожно перемешивать. Проверить рН среды с помощью универсального индикатора. Для этого стеклянной палочкой наносят каплю раствора на универсальную индикаторную бумагу и по шкале окраски определяют рН. При рН 4,6 - 4,8 казеин выпадает в осадок. Ему дают отстояться, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок казеина.

Сделайте вывод о содержании казеина в молоке и о возможных способах его выделения.

Опыт 2. Определение изоэлектрической точки желатина

Природные белки в зависимости от аминокислотного состава могут быть кислыми или основными. Большинство природных белков относится к кислым или слабокислым, за исключением протаминов и гистонов, которые содержат избыток диаминомонокарбоновых кислот (аргинин, лизин, гистидин, обуславливающих щелочной характер белков)

Изменяя концентрацию водородных ионов в среде при добавлении буферных растворов с заданным рН, можно изменить константу диссоциации белка как кислоты так и основания. Схематично это можно представить следующим образом:

СОО^- +Н⁺ СООН +Н⁺ СООН

Белок - СОО^- Белок - СОО^- Белок - СООН

NН₃ ⁺ NН₃⁺ NН₃⁺

Анион белка Катион белка

⁺NH₃ +ОН^_ NH₂ +ОН^_ NH₂

Белок - СОО^- Белок - СОО^- Белок - СОО^-

⁺NН₃ ⁺NН₃ NН₂

Катион белка Анион белка

Однако при определенном значении рН среды (неодинаковом для различных белков) степень кислотной диссоциации белковой частицы станет равной степени диссоциации белковой молекулы как основания, т.е. число отрицательных зарядов белковой молекулы сравняется с числом положительных зарядов. Заряд такой молекулы в целом практически равен нулю. Такое состояние белка называется изоэлектрическим, так как в электрическом поле такой белок не будет продвигаться ни к катоду ни к аноду. Значение рН раствора, при котором белок находится в изоэлектрической состоянии, называется изоэлектрической точкой.

Изоэлектрическая точка является характерной константой белков и зависит от аминокислотного состава белковой молекулы.

Растворы белков в изоэлектрической точке вследствие электронейтральности молекул белка наименее устойчивы, легко осаждаются. В качестве стабилизирующего фактора остается только гидратная оболочка. Присутствие солей может либо увеличить, либо уменьшить растворимость того или иного белка.

Ход работы:

Для определения берут 6 пробирок. В каждую из них помещают по 6 мл буферной смеси, пользуясь таблицей 2.

Таблица 2

Объемы сливаемых растворов, мл

Раствор, мл	Номер пробирки
.	1	2	3	4	5	6
СН3СООNa, 0,1 н	2	2	2	2	2	2
СН3СООН, 0,1 н.	0,25	0,50	1	2	4	-
СН3СООН, 1 н.	-	-	-	-	-	0,8
Дистиллированная вода	3,75	3,50	3	2	-	3,2

Тщательно перемешивают содержимое пробирок и добавляют в каждую из них по 2 мл 1%-ного раствора желатина. Затем в пробирку №4 медленно, при помешивании добавляют столько этилового спирта, чтобы спустя некоторое время оставалась едва заметная муть. Обычно для этого требуется 8 мл спирта. Во все остальные пробирки прибавляют при помешивании точно столько же спирта сколько прибавлено в пробирку № 4. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 20-30 мин. Спустя это время во всех пробирках появляется помутнение. Наибольшее помутнение наблюдается в той пробирке, рН в которой соответствует изоэлектрической точке желатина.

Результаты наблюдений записывают в виде таблицы 3. В графе «Степень коагуляции» отсутствие помутнения обозначают знаком (-), наличие его - знаком (+), значительное помутнение - несколькими плюсами.

Таблица 3

Результаты определения изоэлектрической точки желатина

Параметр	Номер пробирок
	1	2	3	4	5	6
рН раствора	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1
Степень коагуляции

Вывод:

Опыт 3. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Высаливанием называют процесс осаждения белка из раствора под действием нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgCl₂ и др. При высаливании белок выпадает в осадок, не подвергаясь денатурации.

При прибавлении к растворам белка солей щелочных и щелочноземельных металлов их ионы адсорбируются на противоположно заряженных группах частиц белка, делая их электронейтральными и тем самым, понижая устойчивость белков в растворе. Кроме того, соли щелочных и щелочноземельных, растворяясь, связывают большие количества воды, что при достаточно высоких концентрациях ведет к дегидратации частиц белка и лишает их гидратной оболочки. Белок при этом выпадает в осадок.

Для осаждения из раствора различных белков используют растворы соли разной концентрации. Глобулины, например, осаждаются полунасыщенным раствором сернокислого аммония, а альбумины - только насыщенным раствором. Объясняется это тем, что частицы глобулинов значительно крупнее частиц альбуминов, что используется для разделения альбуминов и глобулинов.

Осаждающиеся при высаливании белки способны вновь растворяться в воде, так как макромолекулы белков при этом, как правило, сохраняют свои природные (нативные) свойства.

Ход работы:

В пробирку наливают 2-3 см³ раствора яичного белка и равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. Выпадает хлопьевидный осадок глобулинов. Осадку дают отстоятся, после чего фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют кристаллический сульфат аммония до насыщения. Выпадает хлопьевидный осадок альбуминов. Осадок снова отфильтровывают. С фильтратом проводят биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белков в фильтрате и полноту осаждения. Осадок альбуминов отфильтровывают и проводят с ним биуретовую реакцию.

Записывают наблюдения и выводы.

Опыт 4. Гидролиз казеина

В зависимости от применяемого катализатора различают гидролиз кислотный, щелочной, ферментативный. При гидролизе простых белков конечным продуктом являются только аминокислоты; сложные белки помимо аминокислот содержат другие соединения (фосфорная кислота, углеводы, нуклеиновые кислоты и др.)

В организме гидролиз белка происходит в процессе пищеварения под действием протеолитических ферментов.

При гидролизе белка происходит разрыв пептидных связей. Белок распадается вначале на высокомолекулярные продукты - пептоны, затем на полипептиды и, наконец, на аминокислоты.

Конец гидролиза можно определить по биуретовой реакции. Если она отрицательная, т.е. нет красно-фиолетового окрашивания, значит гидролиз полный, в растворе присутствуют только отдельные аминокислоты. Биуретовая реакция положительная, если в растворе есть белок или полипептиды, так как они являются индикатором на пептидную связь -СО=NН-

Ход работы:

Для проведения гидролиза осадок, полученный в работе 1 (казеин молока), переносят с фильтра в широкую пробирку с обратным холодильником и приливают 6 см³ 10%-ного раствора гидроксида натрия.

Пробирку нагревают на песчаной бане в течение 1 часа (под тягой). Жидкости дают остыть и нейтрализуют ее концентрированной азотной кислотой (20-30 капель) до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка.

Жидкость фильтруют, с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию. К пяти его каплям прибавляют 5 капель 10%-ного NaОН и 2 капли 1%-ного раствора CuSO₄. Наблюдают фиолетовое окрашивание.

Для контроля берется немного казеина (на кончике ланцета), который растворяется в 1-2 см³ воды, и затем проделывается биуретовая реакция. Наблюдается красно-фиолетовое окрашивание. Сделать вывод.

Задание:

1. Изучить методические указания и ход предлагаемых работ.

2. Провести опыты данных работ.

3. Письменно подготовить отчет по занятию: записать цель, название опытов, ход их проведения, результаты опытов и выводы.

4. Сделать вывод о возможности выделения белков, их фракционирования и гидролизе.

5. Защитить работу и сдать теоретический материал по контрольным вопросам темы: «Химия белков».

Задание для СРС: подготовить теоретический материал по теме: «Обмен белков».

Контрольные вопросы:

1. Какие вещества называются белками?

2. Основные химические элементы, составляющие белок.

3. Дайте понятие о полноценных белках.

4. Каковы физико-химические свойства белков?

5. Какова теория строения белков?

6. Назовите структуру белковых молекул. Какими связями удерживается первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

7. Дайте классификацию белков.

8. Дайте характеристику отдельным классам простых белков.

9. Дайте характеристику отдельным классам сложных белков.

10. Каковы функции белков?

11. Каковы способы выделения белков из природного материала?

12. Назовите возможные способы фракционирования белков и пептидов.

13. Каким образом определяется аминокислотный состав белков?