Занятие 3 Тема: Реакции осаждения белков.

Цель: Освоить различные методы осаждения белков.

Материальное обеспечение:

Продукты: 1% раствор несолевого яичного белка; 1% раствор солевого белка.

Реактивы: спирт этиловый, 96%; ацетон; хлороформ; 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 1% раствор уксусной кислоты; 2% раствор гидроксида натрия; 10% раствор сульфата меди; 5% раствор уксуснокислого свинца.

Посуда и оборудование: пробирки; пипетки; спиртовки; штатив; цилиндр мерный на 10 см³.; спички; держатель для пробирок.

Методические указания

Используя различные реагенты и условия можно лишить частицы белка заряда и разрушить их гидратную оболочку, при этом происходит осаждение белка.

В большинстве случаев осаждение белка сопровождается его денатурацией. Глубина денатурации белка может быть различной; она зависит от природы белка, характера реагента и времени его воздействия. В связи с этим осаждение может быть обратимым и необратимым. При обратимом осаждении не происходит глубоких изменений белка, так что осадок белка можно повторно растворить в первоначальном растворителе. При необратимом осаждении белок претерпевает глубокие изменения: нарушаются не только четвертичная и третичная, но зачастую и вторичная структура белковой молекулы

Опыт 1. Осаждение белков при нагревании

Большинство белков при нагревании подвергается необратимому осаждению (необратимой денатурации). Механизм тепловой денатурации заключается в перестройке пространственной структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет нативные свойства, поэтому резко уменьшается его растворимость. Некоторые белки, например яичный, при нагревании приобретают упругость. Процесс денатурации протекает постепенно и ускоряется с повышением температуры.

Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке, т.е. таком значении рН среды, когда белковые частицы нейтральны.

Почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде.

В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-нибудь нейтральной соли (NaCl, NH₄Cl и др.) Добавление к растворам белка солей ускоряет процесс осаждения белка.

Добавление к растворам белка сахаров, многоатомных спиртов, альдегидов, аминов, кетонов защищает белки от свертывания В этом случае свертывание происходит при более высокой температуре и более продолжительном нагревании.

Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в сильнокислой среде и усиления отрицательного заряда в щелочной среде.

Полное и быстрое осаждение белков происходит при достижении изоэлектрической точки.

Изоэлектрической точкой называется такое значение pH, при котором частицы белка не передвигаются в электрическое поле ни к аноду, ни к катоду, и, следовательно, суммарный заряд их равен нулю.

Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (pH около 5,0), за исключением протаминов и гистонов, имеющих изоэлектрическую точку в щелочной среде (pH около 8,0). Это объясняется тем , что протамины и гистоны в отличии от других белков содержат избыток диаминомонокарбоновых кислот - аргинина, лизина, гистидина, обусловливающих щелочной характер белков.

Итак, важную роль в свертывании белков при нагревании играет концентрации водородных ионов, т. е. определенная реакция среды и присутствие солей.

Ход работы:

Сравнивают отношение к нагреванию нейтральных, слабокислых и сильнокислых солей, а также щелочных растворов белка.

В пять пробирок наливают по 5 капель 1%-ного раствора несолевого белка (без N aCl). В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения . Жидкость мутнеет, т.е. наблюдается опалесценция, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг белка и происходит укрупнение взвешенных частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во второй пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты для слабого подкисления. При стоянии выпадает хлопъевидный осадок белка. Частицы белка теряют заряд , так как приближаются к изоэлектрическому состоянию.

В третью пробирку добавляют 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд , что повышает их устойчивость.

В четвертую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты и две капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопъевидный осадок белка , так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия.

В пятую пробирку добавляют 2 капли 2%-ного раствора гидроксида натрия , что создает щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Отметить положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный - минусом. Запись в таблицу 4 результаты осаждения белков при кипячении в различных средах и указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка.

Таблица 4

Осаждение белка при кипячении в различных реакциях среды

Нейтральная среда	Слабокислая среда	Сильнокислая среда	Сильнокислая среда+электролит	Щелочная среда

Опыт 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей.

Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO₃), но нерастворимые в воде.

Соли тяжелых металлов вызывают необратимые изменения белков, т. е. денатурацию.

Растворения осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие появления одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков в воде используется при отравлении солями ртути, меди свинца и др., пока эти соли еще не успели всосаться. В качестве противоядия применяют белки молока, яиц.

Ход работы:

1. Осаждение белков медным купоросом .

К 2 см³ несолевого раствора яичного белка прибавляют осторожно 1-2 капли 10%-ного раствора сернокислой меди, образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой, такой же порции раствора белка приливают вначале 1-2 капли 10%-ного раствора сернокислой меди, а затем еще 5-10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2. Осаждение белков уксуснокислым свинцом.

К 2 мл несолевого раствора белка прибавляют одну каплю 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Образуется осадок также нерастворимый в воде, но легко растворяющийся в избытке осадителя ( избыток создается 5-10 каплями реактива).

Опыт 3. Осаждение белка органическими растворителями

Спирты, ацетон, хлороформ и другие органические растворители осаждают белок из раствора. Дело в том, что эти растворители разрушают водную оболочку частиц белка и, тем самым, понижают устойчивость в растворе, вызывая выпадение белка в осадок. В зависимости от температуры, времени действия и природы органического растворителя осаждение белка может быть обратимым и необратимым. Если осаждение белка производить при комнатной температуре и осадок быстро отделить от избытка органического растворителя, то осажденный белок можно вновь растворить в воде. При продолжительном взаимодействии белка с органическими растворителями он изменяется настолько глубоко, что белковый осадок в воде растворяется. В присутствии нейтральных солей (NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др.) осаждение белка органическими растворителями усиливается вследствие снятия заряда с белковой частицы, что еще больше снижает устойчивость раствора белка.

Ход работы:

В три пробирки наливают по 1 см³ раствора яичного белка и энергично встряхивают. Затем в первую пробирку приливают 2 см³ 96%-ного этилового спирта, во вторую - 2 см³ ацетона и в третью - 2 см³ хлороформа. Содержимое пробирок встряхивают и оставляют на 5-10 мин. Наблюдения и выводы записывают в тетрадь.

Опыт 4. Осаждение белков трихлоруксусной кислотой

Трихлоруксусная кислота (CCl₃COOH) является очень чувствительным и специфическим реактивом на белок, поэтому ее используют для осаждения белков в биологическом материале. Трихлоруксусная кислота осаждает из раствора только белки, но не осаждает продукты их гидролиза. Это особенно важно для разделения белковых и небелковых азотсодержащих веществ.

Ход работы:

В три пробирки наливают по 1 см³ растворов яичного белка и добавляют несколько капель 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты до появления осадка. Наблюдения и выводы записывают в тетрадь.

Задание:

1. Изучить методические указания и ход предлагаемых работ.

2. Провести выше описанные опыты.

3. Письменно подготовить отчет по занятию: записать цель, название опытов, ход их проведения, результаты опытов и выводы.

4. Сделать вывод о возможных способах осаждения белков.

5. Защитить работу и сдать теоретический материал по контрольным вопросам темы: «Обмен белков».

Задание для СРС: подготовить теоретический материал по теме: «Ферменты».

Контрольные вопросы

1. Расскажите о ферментативном гидролизе белков пищи в желудочно-кишечном тракте.

2. Промежуточный распад аминокислот. Напишите реакции дезаминирования, переаминирования, декарбоксилирования аминокислот. Каковы продукты данных реакциий?

3. Каковы пути обезвреживания аммиака в организме?

4. Расскажите об орнитиновом цикле мочеобразования.

5. Дайте понятие о положительном и отрицательном азотистым балансах. Назовите факторы, влияющие на азотистое равновесие.

6. Дайте характеристику ДНК, строение, локализация в клетке.

7. Назовите основные виды РНК, строение и связь с биосинтезом белка.

8. Биосинтез белка в организме, его основные этапы.

9. Назовите необходимые условия для биосинтеза белка.