биофизика

Однослойные липосомы можно получить различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25 - 30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более.

Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточных мембран.

Липосомы нашли непосредственное применение в медицине. Например, можно заключить внутрь липосом лекарственный препарат и использовать как фосфолипидную микрокапсулу для доставки лекарства в определенные органы и ткани. Липосомы не токсичны (при правильном подборе липидов), полностью усваиваются организмом, способны преодолевать некоторые биологические барьеры. Так, инсулин, заключенный в липосому, защищен от действия пищеварительных ферментов. В настоящее время выясняется возможность вводить этот препарат в липосомах перорально, что может избавить больных диабетом от необходимости систематических уколов. Проводятся работы по разработке методов липосомальной терапии опухолей, ферментативной недостаточности, атеросклероза. Изучается возможность прицельной доставки лекарственного препарата, заключенного в липосомах, к больному органу или даже к больному участку (в частности, к пораженному участку сердца).

Для этого к липосоме присоединяется белковая молекула - антитело к соответствующему мембранному антигену органа-мишени. Липосомы с током крови разносятся по всему организму и задерживаются, оказавшись около органа-мишени.

Рис. 2.5. Плоские бислойные липидные мембраны

31

Несмотря на заманчивые перспективы липосомальной терапии, еще имеется достаточно много нерешенных вопросов.

Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) - другой тип модельных мембран.

Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пластика (например, фторопласта), погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка-торуса у краев отверстия.

Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широко используются в качестве моделей для изучения электрических свойств мембраны, их проницаемости и других научных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, а том числе, барьерную (например, селективность проницаемости - хорошую проницаемость для воды и плохую для ионов). Можно моделировать биологический транспорт, вводя в модельную мембрану молекулы-переносчики.

Транспорт веществ через биологические мембраны

Рис. 2.6. Транспорт веществ через биологические мембраны

Из определения активного транспорта следует, что его важнейшим свойством является перенос веществ вопреки действию физико-химических градиентов (вопреки

32

электродиффузионному уравнению Нернста-Планка), то есть в сторону более высокого электрохимического потенциала благодаря термодинамическому сопряжению концентрационного и электрического градиентов с расходованием свободной энергии организма. Поэтому система уравнений переноса выглядит так:

dm		A	grad C A	grad U A
dt		11	12	13		x
dq		A21	grad C A22	grad U A23	x
dt
d		A	grad C A	grad U A
		31	32	33
dt						x

Химический потенциал ( x) количественно характеризует вклад ферментативных реакций в свободную энергию биомембраны, необходимую для преодоления сопряжённого действия концентрационного и электрического градиентов. Если изменения свободной энергии клетки, обеспечивающие активный транспорт через мембрану, обусловлены макроэргами (АТФ), то в этих уравнениях: ν – число молей АТФ, затраченных на массоперенос, а μх равен приросту свободной энергии клетки при гидролизе 1 моля АТФ (в стандартных условиях это составляет 31,4 кДж моль-1).

Сказанное позволяет сформулировать второе характерное свойство систем активного транспорта – необходимость энергетического обеспечения за счёт свободной энергии, выделяющейся либо непосредственно в ходе окислительно-восстановительных реакций, либо при гидролизе макроэргов, синтезированных впрок при тех же реакциях. Необходимо подчеркнуть, что свободная энергия, обеспечивающая активный транспорт, черпается биомембранами в ходе химических процессов, связанных непосредственно с переносом веществ через них, то есть из химических реакций, в которых участвуют сами мембранные компоненты систем активного транспорта. В этом состоит коренное отличие активного транспорта от других способов транспорта веществ через БМ, также нуждающихся в затратах свободной энергии. Оно станет понятнее после рассмотрения облегчённой диффузии.

Свободная энергия ( G), затрачиваемая на трансмембранный перенос одного моля вещества в направлении более высокого электрохимического потенциала, рассчитывается по формуле: ( G = RT ln(C1/C2) где C1 > C2.

У человека в покое примерно 30 – 40% всей энергии, образующейся в ходе метаболических процессов, расходуется на активный транспорт. В некоторых случаях на

33

его обеспечение может затрачиваться почти вся свободная энергия, вырабатываемая клеткой. Ткани, в которых активный транспорт особенно интенсивен, потребляют много кислорода даже в покое.

Третье свойство систем активного транспорта заключается в их специфичности: каждая из них обеспечивает перенос через биологические мембраны только данного вещества (или группы их) и не переносит другие. Правда, активный транспорт ионов натрия бывает сопряжён с пассивным переносом в том же направлении других веществ (например глюкозы, некоторых аминокислот и т.д.). Это явление называют симпортом. Некоторые системы активного транспорта переносят одно вещество в данном направлении, а другое – в противоположном. Так, калий-натриевая помпа закачивает калий из межклеточной среды в цитоплазму и откачивает натрий из клетки. Такой вид транспорта называют антипортом.

Когда эти ионы начинают перемещаться через биологическую мембрану в направлении более низкого электрохимического потенциала, то натрий-калиевая помпа становится генератором АТФ. Это явление получило название эффекта обращения систем активного транспорта: на перекачивание ионов в сторону более высокого электрохимического потенциала насосы затрачивают свободную энергию, гидролизуя АТФ, тогда как при движении ионов в противоположном направлении они преобразуют энергию градиентов в энергию макроэргической связи АТФ, синтезируя его из АДФ. Специфичность систем активного транспорта служит одним из самых действенных механизмов селективной проницаемости клеточных мембран и придания им векторных свойств.

Всоставе любой системы активного транспорта веществ через БМ можно выделить три основных компонента: источник свободной энергии, переносчик данного вещества, сопрягающий (регуляторный) фактор. Последний сопрягает работу переносчика с источником энергии. Все компоненты систем активного транспорта образуют сложный молекулярный комплекс в клеточной мембране.

Вбольшинстве известных систем активного транспорта непосредственным источником свободной энергии служит АТФ. За счёт присоединения его концевой фосфатной группы, предварительно оторванной при гидролизе, к мембранному переносчику последний фосфорилируется и приобретает дополнительную энергию, достаточную для преодоления физико-химических градиентов, препятствующих движению переносимого вещества. Следовательно, фосфорилированный комплекс переносчика с транспортируемым веществом способен преодолеть потенциальный барьер,

34

неприступный для него до фосфорилирования. Отдавая перенесённое вещество на противоположной стороне биологической мембраны, молекулы переносчика дефосфорилируются и теряют энергию.

Реже свободная энергия черпается системами активного транспорта непосредственно из окислительно-восстановительных реакций, то есть из цепи переноса электронов.

О переносчиках, обеспечивающих активный транспорт, известно пока немногое. По-видимому, в разных системах активного транспорта работа переносчиков осуществляется посредством различных механизмов. Во-первых, переносчиками могут быть сравнительно мелкие белковые молекулы, присутствующие в биологических мембранах. В этом случае молекула переносчика, приняв транспортируемое вещество, проходит всю толщу биомембраны, работая по типу малой или большой карусели. Вовторых, переносчиками могут служить крупные молекулы мембранных белков, насквозь пронизывающие фосфолипидный бислой. Им, вероятно, свойственны такие механизмы, как ротация или сдвиг.

Третий компонент системы активного транспорта обеспечивает сопряжение работы переносчика с источником энергии. Такое сопряжение может заключаться в переносе фосфатной группы с АТФ на переносчик. Чтобы фосфорилировать переносчик, нужно прежде гидролизовать АТФ. Гидролиз АТФ достаточно эффективен только в присутствии специальных ферментов, называемых АТФазами. Они-то и служат фактором, сопрягающим работу переносчика с источником энергии в основных системах активного транспорта (натрий-калиевой и кальциевой помпах). Название этой ферментной системы употреблено во множественном числе не случайно. Для активного транспорта каждого вещества в тех случаях, когда источником энергии является АТФ, обнаружена специфическая АТФаза. Каждая из транспортных АТФаз активируется именно тем веществом, чей активный транспорт она обеспечивает. Например, Са-активируемая АТФаза переходит в активное состояние только тогда, когда концентрация Са2+ в примембранном пространстве достигает определённого уровня, при котором необходим активный транспорт этого иона.

Все транспортные АТФазы связаны с клеточными мембранами и проявляют высокую специфичность, катализируя реакции, течение которых строго зависит от направления подхода к БМ транспортируемых веществ. Так, Na-К-активируемая АТФаза приобретает активность при взаимодействии с нею натрия внутри клетки, а калия –

35

снаружи. Она не активируется при самых значительных концентрациях натрия в межклеточной среде и калия – в цитозоле.

Зависимость потока (Ф) переносимого вещества через клеточную мембрану от его концентраций по обе её стороны (Сi и Се) при участии транспортной АТФазы описывается

		СА р		Сi
	Ф					Сe
		2					,
уравнением:			ki Ci			ke Ce		где СА	– концентрация АТФазы в

биомембране, р – проницаемость мембраны для комплекса “переносимое вещество – фермент”, ki и kе – константы диссоциации этого комплекса на внутренней и наружной поверхностях биологической мембраны.

В клеточной мембране постоянно присутствуют и переносчики, и транспортные АТФазы, в примембранном пространстве клетки находится АТФ, выходящий из митохондрии, которые подтягиваются к местам активного транспорта. Однако вся система не работает до появления определённого стимула, которым обычно служит нарастание концентрации вещества, подлежащего активному транспорту. Это вещество активирует специфическую АТФазу, которая, в свою очередь, катализирует гидролиз АТФ с отщеплением концевой фосфатной группы. Присоединяясь к переносчику, она фосфорилирует его. При фосфорилировании переносчик приобретает дополнительную свободную энергию, необходимую и достаточную для трансмембранного переноса вещества вопреки действию физико-химических градиентов.

Так, внутри клетки повышение содержания Na+ выше определённого уровня активирует Na-K-активируемую АТФазу, а она – реакцию гидролиза АТФ:

Na

Na K активируемая АТФаза

АТФ Н2О АДФ Н3 РО4 .

Пассивный транспорт Осмос – прохождение растворителя через полупроницаемую мембрану из области с

меньшей концентрацией вещества в область с большей концентрацией за счет осмотического давления. Данное явление может быть проиллюстрировано одним из методов выделения мембран (можно встретить термин «теней») эритроцитов. Эритроцит помещают дистиллированную воду. За счет осмотического давления растворитель (вода) проникает через полупроницаемую мембрану внутрь эритроцита, он набухает и лопается. В результате исследователь получает мембрану.

36

Электроосмос – перемещение растворителя с полярными молекулами под действием электрохимического градиента.

Фильтрация – проникновение растворителя через полупроницаемую мембрану под действием гидростатического давления.

Свободная диффузия. Диффузия состоит в молекулярном движении вещества из области с большей концентрацией (С1) в область, с меньшей концентрацией (С2). При переносе молекул через мембрану толщиной l и площадью s уравнение переноса, определяющее скорость диффузии, имеет вид: dm/dt = - D×s×lim[(С1- С2)/l], где D – коэффициент диффузии.

С учётом того, что обобщённой координатой в данном уравнении является масса переносимого вещества (хi = m), а обобщённой силой – концентрационный градиент, и обозначив произведение D на s величиной AD получим: dm/dt = AD×grad(C).

Нернст установил, что для молекул сферической формы зависимость D от силы трения (Fтр) отображается следующим выражением: D = [(R×T)/NA]×[1/Fтр], где R – универсальная газовая постоянная (R = 8,32 103 Дж К-1 кмоль-1), T – абсолютная температура, NA – число Авогадро.

По закону Стокса: Fтр = 6π r, где – вязкость среды, r – эффективный радиус диффундирующей молекулы (радиус Стокса–Эйнштейна), представляющий собой радиус не реальной молекулы, а эквивалентной сферической частицы, имеющей тождественную диффузионную способность.

Из формул Нернста и Стокса следует формула Стокса–Эйнштейна:

D = (RT)/(6π rNA), [м2 c-1].

Таким образом, первый закон Фика (физиолог А. Фик пришел к нему эмпирическим путем в 1855 г.) может быть записан в следующем виде:

dm/dt = D×s×grad(C)

Этот закон лежит в основе биофизических механизмов транспорта веществ в организме. Уравнение Фика с успехом применяется в технике при решении многих задач, связанных с переносом газов и жидкостей. Закон Фика является основой конструирования ряда биотехнических систем. Например, в аппаратах экстракорпорального кровообращения по формуле Фика рассчитывают диффузию газов в оксигенаторе, а в приборе “искусственная почка” – диффузию веществ через мембрану ионообменника.

Облегченная диффузия. Облегчённой диффузией (ОД) называют транспорт веществ через клеточные мембраны, который происходит в том же направлении, что и

37

свободная диффузия, но гораздо быстрее. Её движущей силой служит электрохимический потенциал на биомембране.

Облегченная Ci диффузия

Свободная

диффузия Ce

Рис. 2.7. Свободная и облегченная диффузия

Другим важным отличительным признаком ОД является эффект насыщения, не свойственный свободной диффузии. По достижении определённой концентрации вещества в примембранном пространстве скорость его переноса через мембрану устанавливается на постоянном уровне и не нарастает при дальнейшем повышении концентрации. Этот признак служит надёжным критерием ОД, так как эффект насыщения довольно легко выявляется при проведении опытов.

Облегчённая диффузия характеризуется рядом свойств, которые типичны для ферментативных процессов. Её температурный коэффициент такой же, как у ферментативных реакций. Ей свойственны различия в скорости транспорта оптических изомеров, а также конкурентное и неконкурентное ингибирование (конкурентные ингибиторы снижают скорость трансмембранного переноса только структурно близких соединений, тогда как неконкурентные – самых разных веществ).

Системами ОД обладают почти все растительные и животные клетки. Между тем, далеко не все вещества транспортируются таким образом. ОД установлена для моносахаридов, аминокислот и некоторых ионов. Все они хорошо растворяются в воде. Очевидно, клетка использует ОД для трансмембранного переноса тех ингредиентов, которые она черпает из окружающей её среды. Механизм ОД присущ многим клеткам млекопитающих по отношению к тем веществам, которые поступают к ним из плазмы крови. Промежуточные продукты обмена (фосфорилированные сахара, макроэрги, продукты метаболизма аминокислот и др.) не способны к ОД в организме. По-видимому,

38

это продиктовано потребностью задерживать их внутри клеток (или определённых органоидов) до завершения метаболических процессов.

ОД обеспечивается нередко переносчиками, которые связываются с молекулами транспортируемого вещества, образуя соединение, подобное фермент-субстратному комплексу. При транспорте с участием переносчика эффект насыщения обусловлен, как правило, вовлечением в транспортный процесс всех молекул переносчика, присутствующих в биомембране.

Для осуществления ОД необходимо беспрестанно снижать концентрацию переносимого вещества внутри клетки (или органоида), поддерживая её фактически на нулевом уровне. Тогда при относительно постоянном и даже понижающемся значении Се устанавливается так называемый благоприятный концентрационный градиент транспортируемого вещества на биомембране. Это достигается включением перенесённого агента в разнообразные метаболические процессы. Примерами могут служить полимеризация мономеров (глюкоза гликоген, аминокислоты пептиды), превращение одного мономера в другой (преобразование одной аминокислоты в другую аминокислоту или в кетокислоту), образование комплексов (например, аминокислотатРНК). Перечислены далеко не все подобные процессы, но даже из приведённых примеров можно понять, что благоприятный градиент поддерживается благодаря ферментативной активности внутриклеточных систем обмена веществ.

Все перечисленные реакции нуждаются в затратах свободной энергии. Она необходима для синтеза полимеров, для образования комплексов, для взаимных превращений мономеров. Поэтому ОД всегда требует энергоснабжения, осуществляемого макроэргическими соединениями. Этим она отличается от свободной диффузии и проявляет определённое сходство с активным транспортом. Однако при активном транспорте свободная энергия выделяется в ходе химических реакций, в которых непосредственно участвуют компоненты транспортной системы, тогда как при ОД затраты свободной энергии не связаны непосредственно с транспортом веществ. Она тратится на создание и поддержание благоприятных градиентов, а не на фосфорилирование переносчика, который при ОД не преодолевает потенциальный барьер, так как транспортирует вещество в соответствии с действием физико-химических градиентов, а не вопреки им.

39

Цитоз

Существует и другой способ проникновения через клеточные мембраны макромолекул. Для него характерно образование мембраны вокруг проникающих веществ. Эта мембрана, покрывающая капли жидкости или скопления плотных веществ, создаётся за счёт мембранных структур той клетки, через плазмолемму которой осуществляется такой транспорт. Его называют фагоцитозом, когда в клетку проникают твёрдые частицы, и пиноцитозом – при прохождении сквозь клеточную мембрану пузырьков с жидким содержимым. Пузырёк (везикула) имеет липидную оболочку, организованную по типу бимолекулярного слоя. Под оболочкой находится капля жидкости, имеющая микроскопические размеры. В ней растворены различные вещества, в том числе макромолекулы. Обнаружено движение везикул как в клетку, так и из неё. В первом случае говорят об эндоцитозе, а во втором – об экзоцитозе (его иногда называют обратным пиноцитозом).

40