Раздел 3

гипс, крахмал, силиказоль и др. Толщина слоя сорбента может быть различной (0,1 мм и более), но обязательно одинаковой в любом месте хроматографической пластинки.

В качестве сорбентов в ТСХ используют силикагель, кизельгур, оксид алюминия, целлюлозу и др. В ионообменных хроматографических пластинках адсорбентами являются различные ионообменники (см. далее). В качестве подвижной фазы применяют либо индивидуальные растворители, либо смеси веществ, взятых в определённом соотношении.

примерыподвижных фаз вТСХ

									хлорорганические
неподвижная фаза -		гексан - ацетон 4:1									пестициды
силикагель		хлороформ - ацетон 9:1									барбитураты

метанол - диэтиловый эфир - аммиак 98:1:1

вещества основного характера

24.2.1. Методика получения плоскостной хроматограммы

Методика получения плоскостных хроматограмм включает в себя следующие этапы:

предварительный этап - подготовка сорбента и исследуемой пробы, подготовка подвижной фазы, насыщение хроматографической камеры;

нанесение исследуемой пробы на хроматографическую пластинку или бумагу;

хроматографирование;

высушивание хроматограммы;

обнаружение пятен (зон) разделённых компонентов пробы.

Нанесение исследуемого раствора на хроматографическую пластинку или бумагу проводят градуированным капилляром, микрошприцом или микропипеткой. Капля наносится касанием капилляра или иглы поверхности пластинки (но не надавливанием, так как при этом можно повредить слой сорбента!). Для предотвращения смывания веществ с пластинки нанесение пятен проводят на линии, находящейся на расстоянии 1-2 см от нижнего края пластинки. Оптимальное количество исследуемого вещества (объём раствора), наносимого на пластинку, обычно определяется экспериментально. Если наносимое количество вещества слишком мало, то его можно не заметить при последующем проявлении. Нанесение на пластинку слишком

302

Инструментальные методы анализа

			большого количества вещества приводит к
			перегрузке сорбента и, как следствие, размы-
			ванию пятна и уменьшению величины Rf
			(рис. 24.2).
			После нанесения исследуемых веществ
			на хроматографическую пластинку или бу-
			магу, последние помещают в хроматографи-
			ческую камеру и проводят хроматографиро-
			вание. Обычно процесс хроматографирова-
			ния ведут до тех пор, пока растворитель не
Рис. 24.2. Изменение по-			поднимется на расстояние 10 см от линии
ложения и		формы пятна	старта.
при увеличении количества			В зависимости от направления движе-
вещества,		нанесённого на	ния подвижной фазы различают следующие
пластинку			варианты плоскостной хроматографии (табл.
			24.1)

			Табл. 24.1.
		Способы получения плоскостных хроматограмм
	Способ		Сущность способа
восходящая			Фронт подвижной фазы перемещается снизу вверх под дейст-
хроматография			вием капиллярных сил. Для получения хроматограммы ис-
			пользуется наиболее простое оборудование - в качестве хро-
			матографической камеры можно использовать любую емкость
			с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в кото-
			рую свободно помещается хроматографическая пластинка.
			Наиболее часто используемый способ получения хромато-
			грамм.
нисходящая			Фронт подвижной фазы перемещается сверху вниз в основ-
хроматография			ном под действием сил тяжести. Для получения нисходящей
			хроматограммы в верхней части хроматографической камеры
			крепится кювета с хроматографической системой, из которой
			с помощью фитиля на хроматографическую пластинку посту-
			пает растворитель.
радиальная			Исследуемое вещество наносится в центр пластинки. Фронт
хроматография			подвижной фазы перемещается от центра к краю пластинки

двухмерная			После получения хроматограммы проводится повторное раз-
хроматография			деление в направлении, перпендикулярном исходному, с ис-
			пользованием подвижной фазы другого состава. Часто ис-
			пользуется в бумажной хроматографии, например, в фар-
			макогнозии при изучении состава лекарственных расте-
			ний.

303

Раздел 3

После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают из хроматографической камеры и сушат. Высушенная пластинка представляет собой хроматограмму исследуемых веществ.

24.2.2. Анализ плоскостной хроматограммы

							Разделяемые компоненты обра-
		фронт элюэнта					зуют на хроматографической пластин-
							ке или полоске хроматографической
							бумаги отдельные зоны (пятна). При-
							мерный вид плоскостной хромато-
							граммы показан на рис. 24.3. Зоны ок-
							рашенных веществ можно обнаружить
				L			визуально. Для обнаружения неокра-
							шенных соединений используют фи-
		x1	x2				зические (например, облучение УФ-
							светом), химические (обработка хро-
							матограммы различными реагентами-
		линия старта					проявителями), а в некоторых случаях
							и биологические методы.
	Рис. 24.3. Примерный вид плоско-						Некоторые из реагентов, исполь-
							зуемых для проявления хроматограмм,
	стной хроматограммы
							показаны в табл. 24.2.

			Табл. 24.2.
Некоторые реагенты-проявители, используемые в
	плоскостной хроматографии
Реагент	Обнаруживаемые		Аналитический эффект
	вещества
Нингидрин	Аминокислоты, пептиды,		Синее (пурпурное, коричневое и
	первичные амины		др.) окрашивание
Реактив	Третичные амины и чет-		Тёмно-оранжевые пятна на жёл-
Драгендорфа	вертичные	аммониевые	том фоне
K[BiI4]	соединения
Раствор SbCl3 в	Стероиды		Фиолетовое окрашивание
хлороформе
FeCl3	Фенолы,	легкоокисляю-	Сине-фиолетовое,	красно-
	щиеся вещества (аналь-		фиолетовое и др. окрашивание на
	гин, амидопирин и др.)		жёлтом фоне
2,4-Динитро-	Альдегиды, кетоны		Жёлтое окрашивание, переходя-
фенилгидразин			щее в красно-коричневое при об-
			работке 10%-ным NaOH

Положение отдельных хроматографических зон на хроматограмме характеризуют с помощью величины Rf, равной отношению расстояния, пройденного зоной вещества от стартовой линии до цен-

304

Инструментальные методы анализа

тра зоны (x), к расстоянию от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта (L)

R f Lx

Величина Rf может принимать значения от 0 до 1. Если Rf = 0, то вещество остаётся на старте, если Rf = 1, то оно поднимается с фронтом растворителя. Величина Rf является качественной хроматографической характеристикой вещества. Она зависит от природы вещества, подвижной и неподвижной фазы, условий хроматографирования и, в определённых пределах, не зависит от концентрации вещества.

Подвижность разделяемых веществ можно также сравнить с подвижностью вещества, принятого за стандарт

R st		R fx		xi
		R fстандарта		x стандарта

Величина Rf связана с коэффициентом распределения вещества

(D) и коэффициентом емкости неподвижной фазы по отношению к данному веществу ( k ) следующими уравнениями:

V

1

1

R

f

D

m

V R

f

1

k

R

f

s

Для того чтобы оценить эффективность разделения в плоскостной хроматографии, измеряют расстояние от стартовой линии до нижнего края пятна данного вещества (x ) и расстояние от ниж-

wней до верхней границы этого пятна (w) - рис. 24.4. Число теоретических тарелок

(N)и высоту эквивалентную теоретиче-

x'	ской тарелке (H)			рассчитывают по фор-
	мулам:
		x		2
линия старта						H	L
		N 16
							N
Рис. 24.4. Расчёт эффектив-		w
ности разделения в плоскост-	Коэффициент разделения ( ) и раз-
ной хроматографии	решение (RS) в плоскостной хроматогра-

фии рассчитывают следующим образом:

305

Раздел 3

	D1		R f21 1
							Rs	2 x
	D2		R f 1	1				w1	w 2
		1

24.2.3. Практическое применение

Плоскостная хроматография используется, главным образом, для обнаружения и идентификации веществ.

окраска зоны вещества либо появление окраски при взаимодействии с реагентом-проявителем

6		4	2		0
			PPM

использование других методов анализа

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ

использование	положение зоны
стандартных	вещества (величина Rf)
веществ

?

С целью количественного определения веществ тонкослойную и бумажную хроматографию применяют значительно реже.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

непосредственно на хроматограмме

после смывания определяемого вещества с хроматограммы

различные инструментальные методыанализа

по площади пятна					фотоденситометрически,
					флуороденситометрически и др.
lgS
		lgC

306

Инструментальные методы анализа

24.3. Колоночная жидкостная хроматография

Вколоночной жидкостной хроматографии сорбент находится в стеклянной или металлической трубке (колонке).

Вклассическом варианте колоночной хроматографии используются сорбенты с диаметром частиц более 100 мкм. Колонка может иметь длину до нескольких метров. Элюент продвигается по колонке под действием силы тяжести.

Ввысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

используются сорбенты, обладающие особыми свойствами (однородность частиц, ненабухаемость и т.д.). Диаметр частиц этих сорбентов не превышает 50 мкм. Часто в ВЭЖХ применяют сорбенты с различными привитыми группами (см. рис. 24.1). Скорость движения подвижной фазы и эффективность разделения в ВЭЖХ значительно выше, чем в классическом варианте хроматографии.

24.3.1. Устройство жидкостного хроматографа

Основные узлы жидкостного хроматографа показаны на рис.

24.5.

ввод пробы

блок подачи

устройство

подвижной фазы

для ввода пробы

резервуары для

колонка

детектор

регистрирующее

подвижной фазы

устройство

Рис. 24.5. Принципиальная схема жидкостного хроматографа

Подвижная фаза подаётся в колонку с помощью насоса. Блок подачи элюента может включать в себя также систему дегазации, устройство для градиентного элюирования, измерители давления. До по-

падания в насос подвижная фаза должна быть профильтрована и освобождена от растворённых в ней газов (“дегазирована”), так как пузырьки газа при попадании в колонку приводят к снижению её эффективности, а при попадании в детектор вызывают беспорядочные колебания нулевой линии.

Ввод пробы в жидкостный хроматограф может проводиться с помощью петлевого дозатора, микрошприца (роль шприца может выполнять сам насос) и др.

Хроматографические колонки в ВЭЖХ, в отличие от газохроматографических колонок, прямые. Они имеют длину 10 - 30 см и внут-

307

Раздел 3

ренний диаметр 4 - 6 мм, а в микроколоночных хроматографах, соответственно, 5 - 7 см и 1-2 мм. Корпус колонки представляет собой цилиндрическую трубку, изготовленную из стекла, нержавеющей стали или полимерного материала. На верхнем и нижнем концах колонки расположены фильтры, представляющие собой диски из пористой нержавеющей стали. Назначение фильтров – удерживание сорбента в колонке и задержка механических примесей, которые могут находиться в подвижной фазе.

В табл. 24.3 перечислены детекторы, наиболее часто используемые в ВЭЖХ.

Табл. 24.3

Характеристика некоторых детекторов, используемых в жидкостных хроматографах

Детектор	Измеряемый сигнал		Определяемые
			вещества
дифференциальный	разность показателей прелом-		универсальный
рефрактометр	ления элюата и элюента
УФ-детектор с фик-	разность между поглощением		вещества,	поглощающие
сированной длиной	элюата и элюента при 254 нм		электромагнитное		излу-
волны (254 нм)			чение с	длиной	волны
			254 нм
спектрофотометри-	разность между поглощением		вещества,	поглощающие
ческий	элюата и элюента при вы-		излучение	с выбранной
	бранной длине волны		длиной волны
флуоресцентный	интенсивность	испускаемого	вещества,	обладающие
	света		флуоресценцией
кондуктометриче-	низкочастотная	электропро-	ионы
ский	водность элюата
потенциометриче-	разность потенциалов ионо-		ионы
ский	селективного	электрода и
	электрода сравнения
вольтамперометри-	сила тока при постоянном по-		вещества,	способные к
ческий	тенциале электродов		электрохимическому
			окислению	или	восста-
			новлению

24.3.2. Практическое применение

Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения, в том числе и препаративного выделения, обнаружения и идентификации, а также количественного определения веществ различной химической природы (как полярных, так и неполярных, как ионов, так и молекул, как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных).

308