Биохимия Р.Марри
.pdf40 |
Глава 36 |
сложная. однако при этом могут возникагь опреде
ленные проблемы. Так, липкие концы вектора могут
лигироваться сами на себя без включения клонируе
мого фрагмента. Кроме того, может произойти от
жиг липких концов двух различных фрагментов, что
приведет к образованию гетерогенной вставки. Ие все интересующие исследователя участки ДИК со держат удобно расположенные сайты узнавания для рестриктаз, дающих липкие концы. Для преодоления
этих трудностей иногда используют рестриктазы,
образующие тупые концы, после чего с помощью
специфического фермента (терминальной трансфе
разы) генерируют новые концы. Так, присоединение к 3'-концам вектора гомополимерной цепочки, со
стоящей из dG. а к 3'-концам клонируемого фрагмен та ДИКцепочки polyd(C)-обеспечивает исклю
чительно межмолекулярный отжиг. В ходе этой про цедуры, получившей название «присоединение ['омо полимерноrо хвоста», образуется также сайт для рес триктазы SmaI, что обеспечивает возможность по
следующего вырезания клонированного фрагмента.
Иногда к тупоконечной ДИК присоединяют синтети
ческие олигонуклеотидные линкеры, содержащие
участки узнавания для определенной рестриктазы.
С использованием ДИК-лигазы бактериофага Т 4
может проводиться инепосредственное лигирование
фрагментов с тупыми концами. Этот метод, менее эффективный, чем лигирование по липким концам,
имеет однако то преимущество, что с его помощью
возможно сшивание любых пар фрагментов. К недо
статкам его следует отнести невозможность легко
проконтролировать ориентацию вставки и число
встроенных фрагментов, а также «вырезаты> клони рованный фрагмент из рекомбинантной молекулы ДИК.
Клонирование
Понятие «клон» определяс гся как большая попу ляция идентичных молекул, бактерий или клеток потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДИК, которые можно охарактеризовать и использо вать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молеку лы ДИК могут быть сконструированы в составе век
торов для клонирования, к которым относятся бакте риальные плазмlЩЫ, фаги или космиды, способные
к репликации в хозяйских клетках под контролем
своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДИК.
Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 36.3.
Бактериальные nлазмиды-это небольшие коль цевые молекулы двухцепочечной ДИК, в функции которых входит, например, обеспечение устойчиво
сти к антибиотикам для несущих их хозяйских кле-
ток. Плазмиды обладают несколькими свойствами.
которые делают их чрезвычайно удобными для
использования в качестве векторов для клонирова
ния: 1) в бактериальной клетке они могут существо
вать в одной или множестве копий; 2) реплицирую тся плазмиды независимо от хозяйской ДИК. В на
стоящее время для многих плазмид уже известна
полная нуклеотидная последовательность. Это де
лает возможным точную локализацию сайтов рес
трикции для клонирования фрагментов ДИК. Плаз
миды значительно меньше хозяйской хромосомной
ДИК и поэтому могут быть легко отделены от нее.
Клонированный фрагмент легко выделяется из ре комбинантной плазмиды посредством ее расщепле
ния той же рестриктазой, по сайту которой проводи
ли лигирование.
Фаrи обычно содержат линейную ДИК, в которую
могут быть встроены фрагменты чужеродной ДИК
по какому-либо из доступных сайтов рестрикции. Химерную ДИК выделяют обычно после заверше ния рекомбинантным фагом литического цикла
и выхода зрелых инфекционных фаговых частиц. Ос новным преимуществом фаговых векторов перед
плазмидными является то, что в отличие от плаз
МИД, способных нести фрагменты ДИК дО fr-l О т. п. н., В фаговые частицы удается встраивать фраг
менты размером до 10--20 т. п. н. Величина КЛОНИ руемого фрагмента определяется общим количе ством ДИК, способным упаковываться в головку
фага.
Фрагменты еще большего размера могут быть клонированы в космидах- векторах, объединяю щих преимущества плазмид и фагов. Космиды- это
плазмиды, содержащие специфические участки, на
зываемые cos-саЙfами, которые необходимы для упаковки ДИК фага л в капсид. Эти вектора могут
поддерживаться в бактериальной клетке в плазмид
ной форме, но так как большая часть ДИК фага из
космиды удалена, то соответственно увеличивается
и возможная длина клонируемого фрагмента. До
вольно обычными для космид являются вставки раз мером 30--50 т. п. н. Свойства векторов трех типов
сравниваются в табл. 36.3.
Когда решается вопрос о том, в какую область вектора ввести клонируемый фрагмент, необходимо учитывать, что вставка в функционально важную по следовательность неизбежно нарушит какое-либо из
свойств вектора. Впрочем, такое нарушение может
быть использовано в целях селекции рекомбинант
ных молекул. Иапример, широко распространенный
плазмидный вектор pBR322 несет гены устойчивости
к двум антибиотикам- амnициллину и тетрацикли
ну. Для клонирования часто используется уникаль
ный PstI-сайт в гене устойчивости к ампициллину.
Встраивание чужеродного фрагмента ДИК приво
дит К инактивации гена ампициллинустоЙчивости.
и бактерии, несущие такую рекомбинантную плаз-
теХ1l0.lOгuя рекомБUllа1lm1lЫХ ДНК |
41 |
РеСТРИКТ838 |
ДНК человеК8 |
|
|
||
ЕсоАI |
|
|
КольцеВ8R |
ЛинеЙН8R молекуЛ8 |
|
ЛЛ83МИДНОЙ ДНК С |
||
ЛЛ83МИДН8R ДН К |
||
липкими КОНЦ8МИ |
||
|
||
|
ДДТТ |
|
|
111111111 |
|
|
ттдд |
|
.. |
Фрагмент ДНК чеповеК8. полученный |
|
в ре3УЛЬТ8те расщеплеНИR той же |
||
ресТРИКТ830Й и имеющий те же липкие |
||
ДНК-ЛИГ838 |
||
концы. что и расщепленнаR ДНК ПЛ83МИДЫ |
||
|
||
МолеКУЛ8 ПЛ83МИДНО" ДНК со |
|
|
встроенным фрегментом ДН К человеК8 |
|
|
(рекомБИН8НТН8R молеКУЛ8 ДНК) |
|
Рис. 36.3. Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных или химерных молекул дик. Введенная
обратно в бактериальную клетку (при трансформации) плазмида реплицируется, а вместе с ней реплицируется и последо вательность-вставка. Поскольку воссоединение липких концов реконструирует сайт узнавания рестриктазы. клонирован ный фрагмент может быть легко выделен из рекомбинантной плазмиды при помощи той же рсстриктазы. Если при этом использовать смесь всех фрагментов. образованных в результате расщепления тотальной ДНК человека одной и той же
эндонуклеазоЙ. то при помощи клонирующих плазмид можно ПОЛУ'IИТЬ около миллиона различных рекомбинант
ных молекул ДИК, каждая из которых дает начало индивидуальному бактериальному клону. (МоdШеd and reproduced,
with permission, from Cohen SN: ТЬе manipulation of genes. Sci. Ат. [July] 1975; 233: 34.)
Таблица 36.3. Широко распространенные векторы для кло Геномные библиотеки и их конструирование
нирования
Подобрав соответствующие условия клонирова
Вектор |
Размер клонируемого фрагмента ДНК |
|
(вставки) |
Плазмида pBR322 |
0,01-10 т. п. н. |
Лямбда Харон 4А |
10-20 т. п. н. |
Космиды |
3550 т. п. н. |
миду. становятся чувствительными к этому антибио
тику (рис. 36.4). Это позволяет легко отличить ис
ходную плазмиду, обеспечивающую устойчивость
бактерии-хозяина к обоим антибиотикам, от реком бинантной формы. Чтобы получить еще более чет
кие доказательства того, что плазмидная ДИК дей ствительно является химерной (несет вставку), мо
жно сравнить размеры сконструированной плазми
ДbI с исходной методом гель-электрофореза_ Реком
бинантная плазмида, естественно, будет иметь боль ший молекулярный вес.
НПЯ, можно добиться того, что в наборе клонирован
ных фрагментов будут содержаться практически все
гены данного генома. Такие коллекции клонов, полу
ченные для конкреrnого генома, называют ['eHoМRLI
ми библиотеками. Геномная библиотека готовится из тотальной ДИК клеточной линии или ткани. В отли
чие от геномной библиотеки библиотека кДИК
представляет популяцию мРИК в ткани. Геномная
библиотека готовится методом частичного расще
пления тотальной ДИК какой-либо «мелкощепя щей» рестриктазой (например, SauIIIA). Смысл та кой обработки заключается в том, чтобы получить популяцию больших фрагментов ДИК, содержащих полноразмерные гены. Для конструирования геном НbIX библиотек предпочтительно использовать фаго
вые векторы, так как они позволяют клонировать
очень протяженные фрагменты ДИК (до 20 т. п. н.). Число независимо полученных фаговых клонов, тре-
42 |
|
Глава 36 |
|
|
Ген устройчивости |
Ген уето"чивости |
|
,.. |
----- К 8МПИЦИЛЛИНУ |
к тетрациклину ---- |
. , |
|
к тетраци клину |
|
Р8екры 8ниеe |
|
КОЛЬц8 |
|
реетриКТ830" |
Pst 1 |
Pstl .. |
|
~ |
|
Встраивание Pstl- |
|
фрагмеН18 |
|
клонируемой днк |
ИеХОДН8R ПЛ83МИДВ рВRЗ22 |
ХимеРН8R ПЛ83МИДВ рВRЗ22 |
Рис. 36.4. Метод выявления рекомбинантных молекул ДИК Фрагмент ДИК встроен в уникальный Pst [-сайт плазмиды pBR322. «Вставка» инактивирует ген, кодирующий белок, который обеспечивает устойчивость бактерии-хозяина к ампи циллину. Следовательно, бактериальные клетки, несущие рекомбинантную ДИК, не способны формировать колонии на
среде, содержащей этот антибиотик. Используя для анализа трансформантов среды с тетрациклином и ампициллином, можно отобрать клоны, несущие рекомбинантные плазмиды.
буемых для создания представительной библиотеки,
обратно пропорционально размеру клонируемых фрагментов, но прямо пропорционально размеру ге нома (табл. 36.4). Библиотека генома человека, со стоящая из 10 б клонов со встроенными достаточно
протяженными фрагментами, с вероятностью около
990/0 содержит любой уникальный ген. Получение такой библиотеки обеспечивает высокую вероят
ность выявления интересующего гена.
Библиотека кДНК готовится в несколько этапов.
Сначала вьщеляют тотальную мРНК ткани, а затем
с помощью обратной транскриптазы и ДНК
полимеразы проводят обратную транскрипцию мРНК в двухцепочечную ДНК. ПО техническим при
чинам редко удается получить полноразмерную ко
пию мРНК (кДНК). Как правило, клонируются бо лее короткие ее фрагменты. Для этой работы обычно
используют плазмиды, так как работать с ними лег
че, чем с фаговыми и космидными векторами. Впро чем, существует целый класс векторов- лямб
доидные фаги,- специально предназначенных для
клонирования кДНК (см. ниже).
Векторы, обеспечивающие синтез белка, кодируе
мого клонированным геном, называют экспресси
рующими. Такие векторы широко используют для
выявления специфических кДНК молекул в кДНК библиотеке, а также для наработки генно
инженерных белков. Специально сконструирован
ные экспрессирующие векторы имеют, как правило,
сильный индуцибельный промотор, кодоны инициа-
Таблица 36.4. Состав представительных геномных библиотек 1)
Источник Представительная геномная библиотека
Е. coli |
1500 |
фрагментов |
Дрожжи |
4500 |
фрагментов |
Дрозофила |
50000 |
фрагментов |
Млекопитающие |
800 000 |
фрагментов |
1) Число фрагментов (независимыx J:ЛОНОВ), необходимое для создания библиотеки, гарантированно представляющей все уникаль ные reHbl, обратно пропорционально среднему размеру J:лонируе
мых фрагментов и прямо пропорционально общему количеству re-
нов данного организма. Числа, приведенные выше, даны для би блиотеJ: с 99%-ной вероятностью представляющих полный геном при размере J:лонируемых фрагментов 2·104 пар нуклеотиДов. Раз личия в необходимом числе индивидуальных J:ЛОНОВ отражают раз
личную степень сложности геномов соответствующих организмов.
Число необходимых J:ЛОНОВ рассчитывается по формуле
lп(1 - Р)
N= ----
In(1 - f) ,
где Р-желаемая вероятность, а f-доля тотального генома в ин
дивидуальном J:лоне. Для млекопитающих, характеризующихся сложностью гаплоидного генома 3·109, зто уравнение будет выгля деть следующим образом:
lп(1 |
- 0,99) |
N= |
. |
2.104J) Iп ( 1- [ --3·109
Преимущество библиотек, сконструированных на основе «ВCTaBoJ:» большого размера, становится очевидным, если произве сти соответствующие вычисления для гипотетичесJ:ОЙ вставки со средним размером 5·103 вместо 2·104.
Технологuя рекомбuнанmных днк |
43 |
ции трансляции для всех возможных рамок считыва
ния, терминаторы транскрипции и трансляции и,
если необходимо, определенные сигналы процессин
га белка. Некоторые экспрессирующие векторы со держат гены ингибиторов протеаз, что увеличивает
выход продукта экспрессируемого гена. Для кон
струирования библиотек кДНК весьма часто ис
пользуется вектор л.gt 11. Этот вектор позволяет клонировать достаточно длинные фрагменты кДНК
и вместе с тем обеспечивает транскрипцию и транс ляцию клонированных генов. Для скрининга кДНК
библиотек, полученных на основе вектора л.gt 11, пригодны как кДНК-зонды, так и специфические ан
титела.
ЗОНДЫ
Для выявления специфического клона в составе геномных или кДНК-библиотек, а также при количе
ственном определении ДНК или РНК используются различные типы молекулярных зондов. Как прави ло, зонды (пробы)-это фрагменты ДНК или РНК, содержащие меченые 32 Р-нуклеотиды. Работа с зон
дами основана на способности последних «узнавать>,
комплементарные последовательности в молекулах
ДНК или РНК. кДНК, синтезированная на матрице специфической мРНК, может быть использована
в качестве зонда при скринировании библиотеки
кДНК и геномной библиотеки. Один из наиболее распространенных методов поиска специфических
последовательностей основан на применении синте
тических олиrонуклеотидов, последовательность ну
клеотидов в которых подбирается по аминокислот ной последовательности неболыuгоo участка иско
мого белка с учетом вырожденности кода. При усло
вии точного совпадения последовательности, длины
олигонуклеотидного зонда в 15--20 звеньев оказы
вается достаточно для достоверной гибридизации и обнаружения уникального гена. кДНК-зонды испо
льзуются также для выявления после электрофореза специфических фрагментов ДНК или РНК и перено
са их на нитроцеллюлозный фильтр (методы «Сау зерн-блоттинга» и «Нозерн-блоттинга» соответ
ственно).
Блоттинг И техника гибридизации
Для визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других «примесных» мо
лекул используется комбинация целого ряда экспе
риментальных приемов, которые в совокупности по
лучили название «блоттинг». На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузерн-блоттингз (для визуали зации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттинга (для РНК) и Вестерн-блоттинга (для белков). Первая про
цедура названа по имени автора методики, осталь
менем стали общепринятыми терминами. Первая
методика полезна при определении количества ко
пий гена (копийности) в данной ткани или при выяв
лении значительных структурных изменений в генах
(делеции, вставки или перегруппировки). Иногда да
же удается выявить точковую мутацию, если она за
трагивает сайт рестрикции. Нозерн- и Вестерн
разновидности блоттинга используются для опреде
ления молекулярных размеров и количества специ
фических РНК и белковых молекул.
Для идентификации и выделения интересующих
исследователя клонов разработан метод гибридиза
ции в бактериальных колониях или фаговых БЛЯlUках. На колонии бактерий, выращенные на
твердой среде, сначала накладывают нитроцеллю
лозный фильтр. Бактерии прилипают к фильтру. По
сле лизиса и денатурации под действием NaOH
и фиксирования денатурированной ДНК прогрева нием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченным зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избьпка зонда и выявляют обра
зовавlUИЙСЯ меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая поло
жение пятна на радиоавтографе с положением коло ний на чаlUке, выбирают ту из них, которая дала по ложительный сигнал. Аналогичным образом посту
пают и при идентификации клонов на основе фаго
вых векторов. Результатом этих манипуляций являе
тся выделение искомых ШlДИВидуальных клонов (бак
териальные колонии или фаговые бляlUКИ).
Все разновидности методов гибридизации, рас смотренные в этой главе, базируются на ВЫlUеупо
мянутых специфических взаимодействиях пар осно
ваний комплементарных цепей нуклеиновых кислот.
точное соответствие последовательностей гибриди зующихся фрагментов приводит к быстрому образо
ванию прочного комплекса, устойчивого к высокой
температуре в ходе гибридизации и отмывки. Такие
комплексы устойчивы также и при низкой концен трации соли. Комплексы, образующиеся при относи тельно более слабом соответствии структуры цепей, в «жестких» условиях (высокая температура или низ кая концентрация соли) менее устойчивы. При этом гибридизация либо не происходит вовсе, либо ги
бридный комплекс раЗРУlUается при отмывке. Ген
ные семейства, у которых наблюдается некоторая
степень гомологии, можно выявить варьированием
условий гибридизации и отмывки. Этот же подход
применяется и при сравнении аналогичных генов
разного видового происхождения.
Определение последовательности ДИК (секвенирование)
В настоящее время разработаны методы опреде
ления полной нуклеотидной последовательности
ные возникли как лабораторный жаргон, но со вреДНК (рис. 36.6). При реlUении этой задачи необходи-
44 |
Глава 36 |
|
Сау:аерн-блот |
НозерН-блот |
Вестерн-блот |
Гель-электрофорез
1 |
1 |
! |
--- |
--- |
--- |
I11 |
"1 |
111 |
Перенос Н8 фильтр |
|
|
|
|
||
! |
!.ДНК-юн.·· |
1"".... |
С зондом |
|
.ДНК-....• |
- |
л.· |
ИнкубаЦИR |
|
c::::Jc::::Jc::::J |
-.- |
|
|
|
Е:::] E::J C::::J |
[::н::::н:;:] |
|
|
|
Р8ДИ088ТОГраф
Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, вьщеленную из культуры клеток или ткани, обрабаты
вают одной или несколькими рестриктазами и ПО_1ученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в ю"арозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных_ После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инку бируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном. и фиксируют полученную
нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом. гибридизую
щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной про
мывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположе нию фрагментов ДНК. комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиаль но не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несКОJlЬКО отличается от метода Саузерна. поскольку молекулы РНК ме нее стабильны. чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью
-специфических антител или других молекулярных зондов.
мо иметь большое количество идентичных молекул |
НЕКОТОРЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ |
ДИК. Наработку интересующей последовательно |
ПРИЛОЖЕНИЯ ТЕХНОЛОГИИ |
сти можно осуществить клонированием соответ |
РЕКОМБИНАНТНОЙ дик |
ствующего фрагмента. Проиллюстрированный на |
|
рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму |
Выделение специфического гена из целого генома |
Гилберту основан на химическом расщеплении ДИК |
требует методики, с помощью которой можно среди |
по определенному основанию. Друтой ферментатив |
миллиона сходных элементов найти один, нужный |
ныIй метод-метод Сэнгера-базируется на приме |
исследователю. Идентификация регуляторной по |
нении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез |
следовательности длиной в 10 нуклеотидов требует |
комплементарной цепи ДИК по одноцепочечной ма |
чувствительности. соответствующей выявлению |
трице в месте встраивания в цепь соответствующего |
1 элемента из 3 х 1О 8. Серповидноклеточная анемия |
аналога. |
вызвана заменой только 1 основания в геноме, т. е. |
|
|
|
|
ТеХ1l0Аогuя реко.wБU1lаЮnllЫХ днк |
45 |
||
Этап 1. |
Вьщеление популяции ( ...... 1012) идентичных молеlCУЛ ДИК |
Этап 4. Полученную ДИК распределяют по 4 пробиркам. В lCаж |
|||||
(Идентичные молекулы, естественно. обладают идентичными кон |
дую пробирку добавляют химический реагент, специфически разру |
||||||
цевыми участками. нуклеотидной последовательностью и длиной.) |
шающий 1 И'1и 2 определенных нуклеиновых основания. В результа |
||||||
Очевидно, что молекулярное клонирование и рестрикция являются |
те ДИК-цепь разрывается в месте нахождения данного НУlCлеотида. |
||||||
наиболее "*фективными методами получения такой популяции мо |
Это расщепление должно контролироваться так. чтобы оно было |
||||||
лекул. |
|
|
|
|
|
неполным и чтобы только часть цепей раЗРЫВё.ыась по всем участ |
|
|
|
|
|
|
|
кам. в которых находится разрушаемое основание. |
|
5'~__~~__~~__~~__~~__~~__~_з' |
|
|
|||||
З'~ |
--~~-- |
~~~-- |
~~-- |
~~~-- |
~5' |
|
|
.этап 2. |
Введение |
ра |
диоакгивной метки в 5'- или 3'-концы каждой цепи.
'Этап 3. Плавление ДИК
ивьщсление популяций
одноцепочечных дЙк.
*~~--r---т---~--~--~--~--~---r--~---r---т--З'
'19
~~~~ ~
РаСUJелл~нuе PaClIJenJleHU~ Росиsеnл~нuе
nоАиС |
по ТиС |
nоС |
Эта процедура генерирует смесь радиоактивно меченных (и
множества немеченых) фрагментов одноцепочечной ДИК различ ной длины. Длина меченых фрагментов соотве rCТByeT числу ну ICлеотидов между меченым концом цепи ( • ) и положением в ней ну
клеинового основания, подвергшегося химической атаке.
Этап 5. Разделение компонентов смеси по размеру с помощью электрофореза в пластине полиакриламидно I о геля. Короткие фрагмеll1 ы мигрируют быстрее длинных. По завершении электрофореза гель помещают на
ренпеновскую пленку. на которой проявляются полосы. соответствующие распределению по длинам мече ных фрагментов в каждой реакционной смеси.
|
HCXOllH(;l$1 послеgо~аmеЛ6носmь |
G G+A Т+С С |
*-;-G-T-C-T-T-G-G-A-G-C-T-~ |
l1erpagupOl1oNH",e OCHOtJOHUf1 L
G G+A Т+С С |
А G Т С Т Т G G Д G С Т |
Orpeзки в правой части рисунка представляют длину фрагментов расщепленной исходной последователь
ности ДНК. Зная. какое из оснований разрушается данным реагентом, можно определить последователь
ность расположения нуклеотиДов в направлении от меченого конца к немеченом}. считывая радиоавтограф
снизу вверх. Правила комплементарных взаимодействий НУlCлеиновых оснований по Уотсону и Крику (Д-Т:
G--C) позволяют восстановить также и последовательность комплементарной цепи.
Рис. 36.6. Определение нуклеотидной последовательности дик (с~квенирование д' IK) по Мак
саму - Гилберту.
46 |
Глава 36 |
|
1 элемента из 3 х 1О 9. Достигнутый сегодня уровень |
фических белков (в том числе сцепленные с х |
|
развития методов генной инженерии достаточен для |
хромосомой), действительно расположены в совер |
|
работы на таком уровне чувствительности. |
|
шенно определенных сайтах хромосом. |
|
Благодаря использованию клонированных фраг |
|
Генетическое картирование |
ментов установлена хромосомная локализация мно |
|
гих генетических нарушений, для которых не удава |
||
|
Под этим термином подразумевается совокуп
ность подходов и методов, с помощью которых мо
жно каждый ген отнести к определенной хромосоме,
т. е. составить генетическую карту организма. На
пример, у человека благодаря применению двух ос новных методов- гибридизации соматических кле
ток и гибридизации in situ - установлена хромосом
ная локализация ряда генов, ответственных за неко
торые заболевания. При гибридизации in situ препа рат метафазных хромосом на поверхности стеклян ной пластины инкубируют с радиоактивно мечен ным зондом. Точную область гибридизации опреде ляют с помощью радиоавтографии (фотографиче
скую эмульсию наносят. непосредственно на пла
стинку). Образование зерен над гистологически иден тифицированной хромосомой позволяет сделать
вывод о принадлежности данного гена к конкрет
ной хромосоме, а часто и к определенному ее участ
ку. Некоторые гены человека, локализованные мето дом гибридизации in situ, представлены в табл. 36.5.
Нет сомнения, что в ближайшие годы карта гено
лось выявить недостаточности по каким-либо специ фическим белкам. К таким заболеваниям относятся: хорея Гентингтона (хромосома 4); муковисцидоз
(хромосома 7); поликистозная нефропатия взрослых
(хромосома 16); мышечная дистрофия Дюшенна (х
хромосома). Если область ДНК, в которой локали
зован дефект, имеет характерную структуру гена
(рис. 36.1), то можно синтезировать этот ген, ввести в соответствующий вектор, добиться экспрессии
и изучать функцию. Кроме того, можно синтезиро
вать олигопептид, последовательность аминокислот
в котором определяется согласно установленной от крытой рамке считывания в кодирующей области. Антитела, полученные против этого пептида, пред
ставляют собой инструмент для выявления экспрес
сии данного пептида (или констатации ее отсут
ствия) у здоровых и больных людей.
Получение белков
ма человека станет полной: более того, обсуждается
принципиальная возможность определения полной
нуклеотидной последовательности человеческого ге
нома. Однако уже сейчас, опираясь на имеющиеся
данные, можно сделать ряд существенных заключе
ний.
1. Гены, кодирующие белки со сходными функ
циями, могут находиться в разных хромосомах (а- и
Р-глобины).
2. Гены, относящиеся к одному семейству, также
могут локализоваться в разных хромосомах (гормон
роста и пролактин).
3. Гены, детерминирующие многие наследствен
ные патологии, вызванные недостаточностью специ
Таблица 36.5. Локализация reHOB человека
Ген |
Хромосома |
Инсулин |
llp15 |
Пролактин |
6p23-q12 |
Гормон роста |
17q21-qter |
а-Глобин |
16pl2-pter |
Р-Глобин |
llpl2 |
Аденозин-дезаминаза |
20q13-qter |
Фенилаланин-гидроксилаза |
1щ24 |
Гипоксантин-гуанин-фосфо |
Xq26-q27 |
рибозилтрансфераза |
|
CerMeHT ДНК G8 |
4р |
Одно из практических применений технологии рекомбинантных ДНК- получение медик0- биологической продукции. Генная инженерия дает возможность получать в больших количествах бел ки, которые не могут быть выделены применением
обычных методов очистки (интерферон, плазмино
ген-активирующий фактор); кроме того, с помощью рекомбинантных ДНК можно нарабатывать специ
фические белки человека для замены используемых
в клинической практике аналогичных белков живот ных (инсулин, гормон роста). Достоинства обеих
технологий очевидны.
Первоначально цели генной инженерии ограни
чивались получением веществ (как правило, белков)
Заболевание
Недостаточность ropMOHa роста а-Талассемия 13-Талассемия, серповидные клетки
Недостаточность аденозин-дезаминазы Фенилкетонурия Синдром Леша-Найхана
Хорея Гентингтона
в таблице представлены хромосомные локализации нескольких генов и болезни, вызванные нарушения
ми в продуктах этих генов. Первой (выделенной) цифрой или буквой указана хромосома. Остальные цифры и буквы детализируют внутрихромосомную локализацию по McKusick V. А. "Мепdеliап Inheritance iп Мап"
6th ed. Johns Hopkins Univ. Press. 1983.
|
|
Технологuя рекомбuнанmных ДНК |
47 |
||
Е |
G'Y |
д'У |
-+fj |
h |
fj |
5' а а а а [] []
10
Инверсия -••
З'
ГеМОГЛОбинопаТИR
(jO-ТалассеМИR
(jO- Тал.ассеМИR
Гемоглобин Лепоре
(A'Yhfj)O-ТалассеМИR
Рис. 36.7. Схема кластера генов f3-глобина и некоторые генетические нарушения, приводящие к заболеваниям. Ген 13- глобина расположен в ll-й хромосоме в непосредственной близости от двух генов у-глобинов и гена о-глобина. Семейство Р-генов организовано в последовательность 5'-l;-Gу-Ау-",Р-О-Р-З'. Локус l; экспрессируется на ранних этапах жизни эмбрио на (a2l;2). Гены у экспрессируются на стадии плода, образуя фетальный гемоглобин (HbF, а2У2). Гемоглобин взрослых со
стоит из НЬА (а2Р2) или НЬА2(а202). Ген ",13 является псевдогеном; его последовательность гомологична последовательно
сти Р-гена, но включает мутации, препятствующие экспрессии. Делеции (затемненные участки) Р-локуса вызывают 13-
талассемию (недостаточность или отсутствие [130] Р-глобина). Делеции 0- иР-генов приводят к образованию гемоглобина Лепоре (образуется только а-гемоглобин). Инвер~ия (~:rIiP)O этой области (незатемненный участок) полностью ингибирует
функцию гена и обусловливает талассемию (тип 111). каждый тип талассемии характерен для определенных этнических
групп. Так (д'уliр)О-талассемия встречается в основном у выходцев из Инди~. В этой области генома картированы и многие
другие делеции, вызывающие определенныи тип талассемии.
для лечения (инсулин), диагностики (тест на СПИД)
и профилактики (вакцина против вируса гепатита В) болезней человека. В настоящее время представле
ния о возможностях биотехнологии значительно
расширились. Так, уже осуществляют~я попытки сконструировать растения, устойчивые к засухе
и экстремальным температурам, а также более эффективно фиксирующие азот.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
И АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПРИРОДЫЗАБОЛЕВАНИЙ
Нормальные генетические варианты
Существуют нормальные варианты последовате
льностей ДИК человека (полиморфизм). Такие ва рианты встречаются примерно 1 раз на 500 нуклео
тидов или 1О 7 раз на геном. Сюда входят делеции,
вставки, а также единичные замены нуклеотидов.
у здоровых людей эти изменения либо не затраги вают кодирующих последовательностей, либо про
исходят в функционально несущественных участках
кодирующих областей ДИК. Полиморфизм структу
ры ДИК может быть прямо связан и с определенны ми заболеваниями. В последние годы феномен поли
морфизма все чаще используется для идентифика
ции соответствующих специфических генов.
Генетические изменения,
вызывающие заболевания
Иа более ранних этапах развития медицинской
генетики существовало представление, что большин ство наследственных болезней вызвано точковыми
мутациями, которые проявляются в функциональ
ном несовершенстве соответствующего измененного
белка. Роль точковых мутаций в возникновении на
следственных патологий действительно велика, к этому следует добавить только, что генетические заболевания могут быть вызваны нарушениями на любой стадии процесса, представленного на рис. 36.1. Это положение хорошо иллюстрируется иссле дованиями гена Р-глобина, имеющего кластерную
организацию и картированного на одиннадцатой
хромосоме (рис. 36.7, 36.8). Биосинтез дефектного р
глобина служит причиной целого ряда заболеваний.
Патологические симптомы могут быть связаны с на
рушениями как в самом гене, так и в его окружении
(табл. 36.6).
Точковые мутации
Классический пример заболевания, связанного
с точковой мутацией,-серповидноклеточная ане мия. Болезнь вызывается заменой всего лишь одно го из 3 х 1О 9 оснований, составляющих полный ге
ном человека: в шестом кодоне Р-глобинового гена
48 |
Глава 36 |
1
5. |
------------------r r |
~/~~ |
~------------------ |
з· |
|
|
|
I |
|
||
|
• |
• |
|
|
|
|
|
|
|
о |
|
Рис. 36.8. Мутации гена Р-глобина. обусловливающие р-тадассемию. Ген представлен в ориентапии 5' - |
3'. Заштрихованы |
||||
нетранслируемые 5'- и 3'-области. При чтении в направлении 5' - 3' затемненные участки - |
экзоны 1 - 3, светлые участки |
||||
интроны 1 и 2. Мутаl\ИИ. затрагивающие контроль транскрипции (8), локализованы в 5'-фланкирующей области. Иденти
фицированы отмеченные на рисунке некоторые nоnsensе-мутации (/:),), мутации, влияющие на процессинг ( О) и расщепле ние РНК (О). в некоторых областях выявлено большое количество мутаций. Такие участки помечены квадратными скоб-
ками.
Таблица 36.6. Структурные изменения в гене (3-глобина
Изменение Затронутая функция Заболевание
Точковые |
Сворачивание белко- |
Серповидноклеточная |
мутации |
вой глобулы |
анемия |
|
Контроль транскрип- |
13-Талассемия |
|
ции |
13-Талассе'\iИЯ |
|
Сдвиг рамки и мута- |
|
|
ции |
130_Талассемия |
Делсция |
Образование мРНК |
|
|
|
Гемоглобин Лепоре |
Перестройка Образование мРНК |
13-Талассемия тип 111 |
|
аденин заменяется на тимин. С измененного кодона
считывается не глутаминовая кислота, а валин. что
приводит к структурным нарушениям молекулы р глобина. Некоторые точковые мутации вызывают снижение либо полную остановку синтеза Р-глобина. Результатом таких нарушений является р
талассемия (талассемии- класс заболеваний, связанных с нарушениями синтеза глобина). На рис. 36.8 представлены позиции точковых мутаций, нарушающих какую-либо из многочисленных ста
дий процесса образования нормальной р глобиновой мРНК и. следовательно. вызывающих Р-талассемию.
Делеl~И, вставки и перестройки ДИК
Исследования геномов бактерий, вирусов, дрож
жей и дрозофилы показывают, что отдельные участ
ки ДНК могут менять свое положение в геноме.
Утрата функционально важного участка ДНК, пере становка фрагментов ДНК внутри гена, вставка
в его кодирующий или регуляторный участок, как
правило, вызывают изменения в уровне экспрессии
данного гена, приводящие к заболеванию. Молеку
лярный анализ P-талассеМJIИ выявляет большое
число подобных случаев (особенно делеций) Создае-
тся впечатление, что кластеры глобиновых генов весьма подвержены повреждениям. Делеции в а
глобиновом кластере, локализованном в 16-й хромо
соме, приводят к а-талассемии. Для большинства
таких делеций отмечена четкая взаимосвязь с этни
ческим происхождением. Жители севера Европы, фи
липпинцы, негроиды и представители средиземно
морских популяций имеют нарушения различного типа, но все они ведут к утрате гемоглобина А и а
талассемии.
Подобный анализ можно провести и для многих
других заболеваний. Обычно точковые мутации идентифицируют путем определения нуклеотидной
последовательности изучаемого гена, но, если мута
ция затрагивает сайт рестрикции, для ее выявления достаточно рестрикционного анализа. Делеции
и вставки ДНК-фрагментов больших чем 50 пар ос
нований определяют методом блоттинга по Саузер
ну.
Ана.;IИЗ родословных
На примере серповидноклеточной анемии можно
убедиться в том, насколько эффективен генно
инженерный подход при изучении болезней челове
ка. Замена основания в кодирующей цепи ДИК гена гемоглобина приводит к изменению последователь
ности, соответствующей шестому коДону:
!
GGАСфСС кодирующая НИТЬ
CCTGAGG Некодирующая НИТЬ
t
G G А С@С С Кодирующая НИТЬ
С С Т G Т G G Некодирующая НИТЬ
При этом исчезает сайт рестриктазы Mst II (ССТ
NAGG: стрелкаМII указаны места расщепления. см. табл. 36.1). Другие Mst П-сайты (рис. 36.9) остаются
ТеХНО.lOгu.Ч рекомБUllQllmllЫХ ДНК |
49 |
АМ" II-сайты В первои поповине генаl3-ГnОбина
Серповидно |
5'--------------------- |
3' |
||
кneточный (5) |
||||
|
, |
1 5 |
_______ |
|
|
T________ |
~ |
~ |
|
Анаnиз POAOCnOBHbIX
Б
Размер
фрагментов
- - - -
f- 1,35 т. П. н.
1-" 1,15 т • n_н.
AS |
AS |
SS |
дд |
AS |
AS Фенотип |
Рис. 36.9. Анализ родословных в случае сеРПОВИДIlОКЛеточной анемии. В верхней части рисунка (А) показано начало гена В-глобина с сайтами расщепления рестриктазой Mst 11 (i) у нормального (А) и серповидноклеточного (S) О-глобина. В резуль
тате расщепления ДНК здоровых индивидуумов рестриктазой Mst 11 образуются специфические фрагменты ДНК разме ром 1,15 и 0.2 т. п. н. Замена одного основания у больных серповидноклеточной анемией приводит к потере одного из трех Mst Il-сайтов в области гена и соответственно к появлению только одного специфического Mst II-фрагмента раз мером 1,35 т. п. н. Это различие в длине легко обнаруживается методом Саузерн-блоттинга (Б). (На данном рисунке поло
жение фрагмента Д:IИНОЙ 0,2 т. п. н. не указано.) Анализ родословных демонстрирует три возможных генотипа. АА-норма
(О), АS-гетерозигота по гену серповидноклеточности «)[]) и SS-гомозигота по гену серповидных эритроцитов (8). Этот подход позволяет осуществлять пренатальную диагностику заболевания серповидноклеточной анемией и выяв-
лять гетерозиготных носителей соответствующего гена (").
неизменными и могут быть расщеплены этой рес |
сайтов рестрикции (как в только что рассмотрен |
триктазоЙ. Поэтому Саузерн-блоттинг обработан |
иом примере). |
ных ферментом образцов ДИК нормальных (АА),
гетерозиготных (AS) и гомозиготных (SS) пациентов
дает три типа распределения фрагментов (рис. 36.9). Этот пример показывает, как на уровне ДИК можно
провести анализ родословной с использованием опи сываемых в 'Этой главе ПРИНЦllПОВ и подходов. Такой
анализ весьма эффективен при изучении ряда генети
ческих заболеваний, вызванных делециями, вставка ми и (реже) точковыми мутациями с изменением
Jlренатальная диагностика
Дородовая диагностика наследственных заболе
ваний возможна, если известна природа генетическо го нарушения и имеется соответствующий зонд. Анализу по Саузерну можно подвергнуть ДНК кле ток, собранных из 1О мл амниотической жидкости (или полученных с помощью биопсии ворсинок хо-