2.7.20. Количественное определение инактивированной вакцины полиомиелита in vivo

Способность вакцины вызывать образование нейтрализующих антител определяют in vivo по одному из следующих методов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЫПЛЯТ ИЛИ МОРСКИХ СВИНОК

Готовят подходящий ряд, состоящий не менее чем из трех разведений испытуемой вакцины с использованием подходящего буферизированного раствора хлорида натрия. Морских свинок массой тела 250-350 г или цыплят возрастом 3 недели распределяют по группам, состоящим из 10 особей, и назначают каждой из групп одно из разведений вакцины. Каждому животному внутримышечно вводят по 0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное относится. Через 5-6 дней проводят забор крови и отделяют сыворотки. Определяют наличие в разведениях сывороток (1:4) нейтрализующих антител к каждому из человеческих полиовирусов: 1, 2 и 3. 100 CCID₅₀ вируса смешивают с разведением сыворотки и инкубируют при 37⁰С в течение 4,5-6 часов. Хранят при 5±3⁰С в течение 12-18 часов. Смеси прививают клеточным культурам для определения присутствия вирусов, не подвергшихся нейтрализации, и ведут регистрацию результатов в течение периода до 7 дней после инокуляции. Для каждой группы животных отмечают количество сывороток, в которых обнаружено наличие нейтрализующих антител, и вычисляют разведение вакцины, дающее такой отклик у 50% животных. Параллельно выполняют контрольный опыт с использованием подходящего препарата сравнения. Вакцина выдерживает испытание, если обнаруживается наличие нейтрализующих антител к каждому из трех типов вируса у 50% животных в разведении вакцины в соотношении 1:100 или более.

ИСПЫТАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРЫС.

Метод количественного определения in vivo состоит из внутримышечного введения в задние конечности не менее трех разведений испытуемой вакцины и вакцины сравнения с использованием для каждого разведения группы из 10 крыс подходящей линии, не содержащих патогенов. Для получения достоверных результатов для всех серотипов часто бывает необходимо использовать четыре разведения. Количество животных в группе должно быть достаточным для получения результатов, отвечающих критериям достоверности; десяти крыс в группе обычно достаточно, хотя достоверные результаты могут быть получены и с меньшим числом животных в группе. Масса тела животного не должна отличаться более, чем на 10% от средней по группе. Каждой крысе вводят по 0,5 мл материала. Диапазон доз выбирают таким образом, чтобы получить дозовый отклик для всех трех типов полиовируса. Забор крови у животных производят через 20-22 дня.

Определяют по отдельности нейтрализующие титры против всех трех типов полиовируса с использованием в качестве провокационных вирусов 100 CCID50 штаммов Sabin, в качестве индикаторных клеток - Vero или Hep2 в условиях нейтрализации, состоящих в инкубации в течение трех часов при 35-37⁰С и 18 часов при 2-8⁰С. Для получения результатов производят фиксацию и окрашивание после семидневной инкубации при 35⁰С. Для признания определения достоверным необходимо показать, что титр провокационных вирусов находится в пределах от 10 до 1000 CCID50, а титр нейтрализующих антител в контрольной сыворотке должен находиться в пределах двух двукратных разведений среднего геометрического титра сыворотки. Активность вакцины вычисляют путем сопоставления количества респондеров на испытуемую вакцину и вакцину сравнения. Анализ выполняют с использованием пробит-метода или, после проверки достоверности, метода параллельных линий. В случае пробит-метода для определения респондера необходимо установить граничный титр нейтрализующих антител для каждого из типов полиовируса. В связи с изменчивостью результатов в разных лабораториях, определить общепринятые граничные значения не представляется возможным. Вместо этого граничные значения определяют в каждой лаборатории, основываясь не менее, чем на трех результатах испытаний вакцины сравнения. За граничное значение принимают среднюю точку в шкале log2 минимального и максимального значений среднего геометрического титров, вычисленных для ряда из трех или более испытаний. Для каждого из трех типов полиовируса активность вакцины не должна быть существенно ниже такой же активности препарата сравнения. Результаты испытания являются достоверными, если:

• как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED₅₀ заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными животным,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности,

• границы доверительного интервала относительной активности находятся между 25% и 400% от оцененного значения активности.