Крахмал -----------глюкоза -------фруктоза

не удается. Это объясняется несовпадением оптимумов рН для двух биокатализаторов.

Задание 2: Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1: Получение липосом стрептомицина сульфата методом «ручного» встряхивания и методом впрыскивания.

Ход работы:

1. 0,2 мл 10 % раствора лецитина, 7,5 мг холестерина растворяют в 10 мл хлороформа. Раствор липидов испаряют в роторном испарителе до получения тонкой пленки. После получения пленки вносят в колбу 1,5 мл 2,5 % раствора стрептомицина сульфата в 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и оставляют на 1 – 2 ч для набухания при комнатной температуре. Для образования гомогенной суспензии липосом в колбу вносят несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивают в течение 5 мин.

2. В пробирку, содержащую 1,5 мл 2,5 % раствора стрептомицина сульфата и 3,5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,5, впрыскивают 0,35 мл 5 % раствора лецитина в этаноле, вводить его следует быстро. Игла шприца должна быть максимально погружена в водную фазу при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки.

Под микроскопом изучают структуру липосом (мультиламиллярные или моноламиллярные), размер.

Электронно-микроскопический контроль размера липосом:

На сетку–подложку наносят взвесь нативных липосом. Препарат липосом на сетке контрастируют 2 % водным раствором фосфорновольфрамовой кислоты (рН 7,4).

Материал исследуют на электронном микроскопе при инструментальном увеличении 5000 – 50000. Размеры липосом измеряют на электронных микрофотографиях.

Липосомы группируют по размерам (очень мелкие, мелкие, средние, крупные и очень крупные). Средний диаметр липосом рассчитывают по формуле:

Д = [( n D_v^-3)/ ( n)]^1/3*(K)-1,

где Д – средний диаметр липосом в препарате, мкм;

D_v –средний диаметр липосом в каждой группе, мкм;

n - число липосом в каждой группе;

К - коэффициент увеличения.

Липосомы нестабильны в водной фазе, поэтому их подвергают лиофильной сушке. Лиофильно высушенные липосомы вносят в лекарственные формы непосредственно перед их использованием.

Вариант 2: Определение оптической активности суспензии липосом в растворах калия хлорида различной концентрации.

Большая часть внутренней воды многослойных липосом осмотически активна, благодаря чему они обладают свойствами идеального осмометра, меняя свой объем в ответ на изменение концентрации наружного раствора. В гипотонических растворах вода устремляется внутрь липосом и они быстро набухают. В гипертонических растворах липосомы сморщиваются за счет потери воды из межламелярного пространства.

Колебания объема липосом в растворах можно определить фотоколориметрическими либо спектрофотометрическими измерениями. Установлено, что при набухании липосом оптическая плотность липосомальной суспензии уменьшается, а при «сжатии» липосом в гипертонических средах – возрастает.

Оптическую активность липосом оценивают измеряя тангенс угла наклона прямой зависимости оптической плотности липосомальных суспензий от концентрации раствора, в которые они помещены.

Практическая значимость исследования состоит:

1. Разработанный метод определения осмотической активности липосом сравнительно прост в техническом отношении и особенно удобен для изучения биомембран разного липидного состава или модифицированных мембраноактивными антибиотиками.

2. В настоящее время ведется интенсивный поиск по выяснению возможностей медицинского применения липосом в качестве средства доставки различных лекарственных препаратов в определенные органы и ткани. Наиболее интересные перспективы практического применения липосом связаны с химиотерапией, лечением диабета, артрита, лейшманиоза, а также введением РНК и ДНК в клетки для решения проблем генной инженерии и биотехнологии.

Ход работы. Отмерить в сухие пробирки спиртовые растворы полярных липидов:

а) 0,4 мл лецитина;

б) 0,2 мл лецитина + 0,2 мл холестерина.

Опустить в спиртовые растворы 1 – 2 стеклянных шарика и выпарить растворы на водяной бане, добавить к выпаренным липидам по 2 мл 50 mМ раствора калия хлорида и интенсивно встряхивать до получения молоковидной суспензии липосом.

Отмерить в 7 пробирок по 4,8 мл раствора калия хлорида в соответствии с данными таблицы. Добавить в каждую из пробирок по 0,2 мл суспензии липосом, тщательно встряхнуть и через 10 мин измерить оптическую плотность при 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контроля используют 50 mМ раствора калия хлорида.

Оптическая плотность суспензий липосом в растворах калия хлорида различной концентрации.

Вариант	Липидный состав липосом	Оптическая плотность (D)								Осмотическая активность (tg )
		№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7
		Концентрация KCl, mМ	5	10	25	50	100	150	200

Построить график зависимости оптической плотности суспензии липосом от концентрации растворов калия хлорида. Рассчитать осмотическую активность липосом, которая численно равна тангенсу угла наклона полученной прямой. Провести сравнительную оценку активности липосом липидного состава. Объяснить влияние холестерина на осмотическую активность липосом, приготовленных из цвиттер-ионных липидов.

Вариант 3: Получение микрокапсул липазы и пепсина методом диспергирования жидкость в жидкости в желатиновую и липидную оболочки.

Ход работы:

1. В котел наливают подсолнечное масло 250 мл и нагревают до 40 С. 5 г желатина растворяют в 25 мл воды с предварительным набуханием и нагреванием. 2,5 г вещества смешивают с раствором теплого желатина. Полученную смесь тонкой струей подают в реактор с работающей мешалкой, от скорости вращения, которой зависит размер микрокапсул. Масло в реакторе охлаждают подачей в рубашку холодной воды. Микрокапсулы отделяют от масла процеживанием через капрон и промывают изопропиловым спиртом. Микрокапсулы сушат на воздухе 24 – 48 ч.

2. В емкость наливают 50 мл 1 % раствора МЦ и нагревают до 35 С. 5 г масла какао расплавляют до жидкого состояния, вносят 2,5 г включаемого в оболочку вещества, получают суспензию. Суспензию тонкой струей при вращении мешалки подают в емкость. Резко охлаждают жидкость, помещая ее на лёд. Получают дисперсию в вязкой среде. Полученная дисперсия может служить концентратом микрокапсул. Микрокапсулы также можно отделить, промывая микрокапсулы на сите холодной водой.

Литература:

1. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

2. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

3. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат. – 1990.

4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

5. Иммобилизация ферментов и других биологически активных веществ. Учебн. пособие/ Сост. проф. Степанова, д.ф.н. Андреева И.Н., к.ф.н. Пантюхин А.В., Сысуев Б.Б. – Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001.

6. Лекционный материал по биотехнологии.

7. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987. – 410с.

8. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416с.

9. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

10. Москвичев Б.В., Шуколюков С.А., Шучихина А.А. Проблемы и перспективы применения иммобилизованных ферментов и других биологически активных веществ в медицине: Центральное бюро научно-технической информации, 1983.

11. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК-Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.

Темы рефератов.

1. Обзорная характеристика новых перспективных методы иммобилизации ферментов.

2. Перспективные направления использования иммобилизованных ферментов.

3. Перспективы иммобилизации целых клеток микроорганизмов и растений.

4. Основные направления применения иммобилизованных клеток.

5. Биокатализ в тонком органическом синтезе.

6. Ферментные электроды на основе иммобилизованных ферментов.

7. Биотехнологическое производство этилового спирта с применением иммобилизованных ферментов.

8. Современные перевязочные средства (с иммобилизованными антибиотиками, ферментами и другими биологически активными агентами).

9. Кровезаменители, основные вещества природного и синтетического происхождения: современное состояние проблемы.

10. Перспективы использования иммобилизованных ферментов в сфере трансформации стероидов.

11. Возможности применения иммобилизованных ферментов в биокаталитическом получении простаноидов.

Приложение 1.

Примеры методов иммобилизации различных видов ферментов.

Адсорбция, или ионный обмен	Каталаза, Рибонуклеаза, -Глюкозидаза, Пепсин, Трипсин, Аспарагиназа
Включение в гель	Лактатдегидрогеназа, Глюкооксидаза, Пероксидаза, Гексакиназа, Рибонуклеаза, Холинестераза, Щелочная фосфатаза, Кислая фосфотаза, -Амилаза, Трипсин, Альдолаза
Поперечная «сшивка» с носителем	Лактатдегидрогеназа, Глюкооксидаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Дезоксирибонуклеаза, Трипсин, Аденозинтрифосфатаза, Альдолаза
Прикрепление к носителю ковалентной связью (азидный метод)	Рибонуклеаза, Холинэстераза, Дезоксирибонуклеаза, Инвертаза, Трипсин, Аспарагиназа, Аденозинтрифосфатаза
Карбидный метод	Глюкозооксидаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Щелочная фосфатаза, Дезоксирибонуклеаза, Трипсин
Бромциан-метод	Аспарагиназа, Ацетилхолинэстераза, Холинэстераза, Аспарагиназа
Метод диазотирования	Глюкооксидаза, Каталаза, Пероксидаза, Рибонуклеаза, Щелочная фосфатаза, -Амилаза, Трипсин
Изотиоцианатный метод	-Амилаза, Трипсин

Приложение 2.