2.4.4 Общая характеристика кисломолочных продуктов.

Как уже отмечалось ранее, кроме вышеперечисленных препаратов для восстановления нормального кишечного биоценоза возможно использование кисломолочных продуктов.

В числе самых верных союзников человека можно назвать молочнокислые микроорганизмы. Мечников И.И. возлагал большие надежды в борьбе со старением и болезнями именно на них, непримиримых противников гнилостной микрофлоры кишечника.

Кисломолочные продукты незаменимы в диетическом и лечебном питании.

Приготовление всех кисломолочных продуктов основано на использовании микробиологических процессов, в развитии которых большую роль играет группа микроорганизмов (молочнокислые бактерии). Многие кисломолочные продукты изготовляются введением в молоко молочнокислых микроорганизмов и дрожжей.

Большая часть палочковидных молочнокислых микроорганизмов – термофилы. Предельно низкая температура их размножения 25 – 28 С, а оптимум развития – 40 – 45 С. Сопротивляемость молочнокислой группы микроорганизмов высоким температурам невысокая; большая их часть теряет жизнеспособность уже при 63 – 65 С при длительности воздействия 10 – 30 мин. Отдельные расы могут обладать значительно большей устойчивостью; на их термостойкость большое влияние оказывают свойства питательной среды: в молоке, благодаря защитным свойствам казеина и особенностям физико-химического состояния жира, они выдерживают температуру на 2 – 5 С выше, чем в водных растворах и бульонах.

Большая часть молочнокислых микроорганизмов являются факультативными анаэробами. Кислотостойкость и предел кислотообразования у отдельных рас микроорганизмов различны.

Все молочнокислые микроорганизмы для своего роста и развития нуждаются в факторах роста, при отсутствии или недостатке которых культуры резко меняют свои свойства и постепенно вырождаются; их способность к кислотообразованию при этом резко падает. К факторам роста относятся, например, витамины.

Многие расы молочнокислых микроорганизмов обладают свойствами синтезировать витамины; этим объясняется лучший рост и развитие данной группы при введении в молоко комбинированных заквасок, состоящих из различных рас молочнокислых микроорганизмов или их сочетание с дрожжами, также способными к синтезу витаминов и антибиотикоподобных веществ. В комбинированных заквасках одни расы могут быть поставщиками факторов роста для других. Стойкость микрофлоры кефирного грибка, способность его микроорганизмов длительное время сохранять активность зависит от взаимного обслуживания прижившихся в субстрате грибка различных рас микробов и дрожжей.

Кисломолочные продукты усиливают деятельность пищеварительных желез, в таких продуктах не разрушаются водорастворимые витамины даже при длительном хранении, что имеет место во всех несквашенных молочных продуктах, особенно при действии света.

В заквашенном молоке при накоплении кислоты происходит постепенное набухание казеина, что способствует его лучшему перевариванию.

Самый факт образования молочной кислоты в активной форме способствует снижению жизнедеятельности посторонней микрофлоры (условно-патогенной, патогенной).

Кефир.

Помимо высоких вкусовых свойств данного продукта, слабо выраженной способности его к перекисанию, внедрению в практику питания кефира, несомненно, способствовали: длительное сохранение кефирной микрофлоры в грибках в активном состоянии при достаточно выраженной способности к кислотообразованию, а также удобство транспорта грибков не только в сухом, но и в «оживленном» виде.

Кефирные зерна или грибки содержат в своем субстрате молочнокислые палочки, дрожжи и кисломолочные стрептококки и их разновидности, образующиеся, кроме молочной кислоты, углекислоту, летучие кислоты и в ничтожных количествах – алкоголь.

В соответствии с наличием в кефирных грибках не только молочнокислой микрофлоры, но и дрожжевой, в кефире при его созревании происходят два вида брожения – кисломолочное и спиртовое.

Состав кефирных зерен, а, следовательно, и кефира может претерпевать большие изменения под влиянием ряда факторов внешней среды. На характер микрофлоры кефира оказывают влияние температура, степень аэрации субстрата и химический состав питательной среды.

В условиях умеренного климата содержание в кефире дрожжевых клеток очень ограниченно.

Ограниченный рост дрожжей отражается на концентрации алкоголя и углекислоты в кефире.

Низкое содержание дрожжевых клеток и алкоголя, возможно, зависит от недостаточной аэрации молока после его заквашивания. Удалось значительно увеличить количество дрожжевых клеток при многократных встряхиваниях молока с погруженными в него грибками.

Размножению дрожжевых клеток способствовало обогащение молока, используемого для приготовления закваски, 1 – 5 % сахара. Высокая температура созревания закваски и кефира (25 – 27 С) способствует усиленному размножению молочнокислой микрофлоры и замедлению размножения дрожжевых клеток; созревание кефира и закваски при температуре ниже 20 С усиливает рост дрожжей. Закваска, содержащая от 2 до 4 дрожжевых клеток в поле зрения микроскопа, обеспечивает в самом кефире в среднем 1 – 2 дрожжевые клетки в поле зрения. Этого количества вполне достаточно для сохранения активности микрофлоры грибка, а концентрация спирта в готовом продукте в этих условиях не превышает сотых процента.

Приготовление грибковой закваски и кефира.

Если кефирные зерна получены молочной кухней в сухом виде, их следует, прежде всего «оживить», т.к. микроорганизмы при высушивании впадают в состояние анабиоза. Сухие грибки заливают кипяченой водой температуры 20 – 30 С. Воду целесообразно через каждые 5 – 6 ч менять. Замоченные грибки постепенно набухают, желтая окраска их теряется; объем грибков увеличивается в 3 – 5 раз; консистенция здоровых грибков обычно упругая, хрящеватая; выраженная дряблость грибков, появление на них слизи сигнализирует об их ненормальных свойствах.

Замачивание в воде со сменой ее через каждые несколько часов продолжается около двух суток, после чего взамен воды грибки погружаются в пастеризованное при 85 – 90 С молоко, предпочтительно – обезжиренное. Температура молока обычно берется 23 – 25 С, выдерживать в молоке грибки целесообразно при несколько меньшей температуре – 18 – 22 С. Имеющиеся в строме грибка микроорганизмы и дрожжи при разбухании зерен обычно переходят в молоко, что и обуславливает развитие в нем молочнокислого и в более слабой степени – спиртового брожения. Иногда в первые дни молочнокислое брожение также бывает слабо выражено и свертывание молока от недостаточно накапливающеся молочной кислоты происходит медленно – за сутки вместо 8 – 10 – 12 ч; в этих случаях грибки пускаются в производство только через 4 –5 дней после начала «оживления», а температуру помещения следует брать несколько более высокую 25 – 27 С. Смена молока в грибках производится ежедневно. Грибки достаточно активные в молоке всплывают на поверхность; молоко для закваски по отношению к объему грибков рекомендуется брать в 8 – 10-кратном количестве. «Оживленные» грибки отфильтровывают от сквашенного молока (закваска) через прокипяченное или простерилизованное в молочном стерилизаторе сито; фильтрат (закваска) также собирается в прокипяченную или стерильную посуду.

Грибки на сите несколько раз промывается струей тепловатой кипяченной воды, после чего они снова заливаются пастеризованным молоком, выдерживается до его свертывания при температуре 20 – 22 С и далее переносятся в более холодное помещение при 8 – 12 С. Кефирная закваска, полученная после отфильтровывания грибков, используется для приготовления кефира; она берется по отношению к молоку в количестве 4 – 5 %; после тщательного перемешивания закваски с пастеризованным охлажденным до 22 – 25 С молоком оно разливается в бутылки, последние укупориваются картонными, ватными или другими пробками и выдерживают при температуре 18 – 20 С до свертывания молока; после свертывания молока бутылки переносятся в холодильник и выдерживаются там до выдачи учреждениям или родителям.

Аналогично готовится и обезжиренный кефир или пахтанья. Молоко для них берется обезжиренное.

В производственных условиях для заквашивания кефира не обязательно ежедневно использовать маточную закваску, т.е. полученную непосредственно после отфильтровывания грибков; можно получать производственную закваску путем пересева уже имеющейся закваски на свежее пастеризованное молоко, заготавливая ее в количестве 4 – 5 % по отношению к объему требующегося кефира, но кефирная закваска не сохраняет свою микрофлору длительное время, постепенно дрожжи и некоторые микроорганизмы уменьшаются в количестве и кефир по вкусу будет напоминать обычную простоквашу; поэтому через каждые 4 – 5 дней снова следует использовать закваску, получаемую непосредственно из-под кефирных зерен.

Кефирные грибки, сохраняющиеся в «оживленном» состоянии, промывать можно 1 – 2 раза в неделю, но ежедневно или, в крайнем случае, через день к ним следует добавить свежее пастеризованное молоко взамен уже свернувшегося

Ацидофильное молоко и ацидофилин.

Ацидофильная палочка представляет собой разновидность болгарской, но она не потеряла способности при введении ее в кишечник приживается там длительное время. Многие расы ацидофильного микроба обладают свойствам синтезировать различные звенья витамина группы В, а также вещества, подобные антибиотикам; это способствовало более широкому внедрению ацидофильных молочнокислых продуктов в практику питания как взрослого населения, так и детей самых различных возрастов. Большая часть рас ацидофильной палочки обладает склонностью к выраженному образованию слизи, а поэтому продукт иногда получается с резко выраженной тягучестью. Тягучесть не влияет отрицательно на здоровье человека, но внешний вид такой простокваши у многих людей вызывает отвращение, поэтому в производственных условиях иногда при составлении заквасок прибегают к комбинированию рас с выраженным слизеобразованием и не обладающих такими свойствами; слизистые расы по отношению к неслизистым берутся в количестве 20 – 25 %. Закваски иногда составляют из сочетания ацидофильных микроорганизмов с другими молочнокислыми бактериями или стрептококками; иногда закваски составляются из различных рас ацидофильных палочек и кефирной закваски; такие кисломолочные продукты называются ацидофилином.

Изготавливается ацидофильное молоко (простокваша) примерно так же, как и другие кисломолочные продукты. Молоко пастеризуется при температуре 85 – 90 С, охлаждается до 45 – 50 С, после чего в него при тщательном перемешивании вводится 4 – 5 % закваски, состоящей из одной или нескольких рас ацидофильных бактерий; заквашенное молоко разливается в бутылочки и ставится для созревания в термостат или теплое помещение при температуре 42 – 45 С.

Ацидофильная палочка может размножаться и при более низких температурах (28 – 35 С), но при этих условиях интенсивно размножаются и другие молочнокислые микроорганизмы, которые могут попасть в молоко из окружающей среды; чтобы получить простоквашу, в которой сквашивание произойдет только за счет ацидофильной палочки, создают такие условия для созревания продукта, которые будут благоприятствовать развитию только выбранных рас микроорганизмов.

Приготовления ацидофилина может осуществляться при более низкой температуре 25 – 35 С. Закваски ацидофильной палочки и других рас молочнокислых микроорганизмов при производстве ацидофилина сохраняются отдельно и вносятся в молоко при заквашивании в равных количествах или с превалированием ацидофильной палочки 3:1 – 4:1. Рост вносимых в молоко микроорганизмов контролируется под микроскопом или путем посева.

Задание 2. Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Изучение морфологии молочнокислых микроорганизмов и ознакомление с методами определения кислотности молочнокислых продуктов и антагонистических свойств молочнокислых микроорганизмов.

а) Изучение морфологических особенностей молочнокислых микроорганизмов.

Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные препараты культур: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Streptococcus lactis.

Приготовить мазок из выращенной на молоке неизвестной культуры молочнокислого микроорганизма, высушить и зафиксировать в течение 10 мин, окрасить по Граму, промикроскопировать и определить, какая из представленных на демонстрации культур идентична выданной в задаче.

б) Определение антагонистической активности молочнокислых микроорганизмов.

1. Приготовить по 1 млрд. бактериальному стандарту взвесь тест-микроорганизмов: St. aureus, E. coli, Bac. subtilis, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae. Взвесь бактерий внести в расплавленный и охлажденный до 45 С мясопептонный агар, взвесь дрожжей – в расплавленную среду Сабуро из расчета 2 мл взвеси на 100 мл среды, разлить в чашки Петри. В застывшей среде сделать лунки.

2. В лунки внести культуральные жидкости молочнокислых микроорганизмов, выращенных в жидком сусле и молоке. Чашки поместить в термостат при 37 С или при 24 С.

3. Измерить зоны задержки роста бактериальных и грибных культур вокруг лунок с культуральной жидкостью молочнокислых микроорганизмов и оценить их антагонистическую активность.

в) Определение кислотности молочных продуктов.

Кислотность молочного продукта определяют титрованием пробы 0,1 н раствором гидроксида натрия: к 1 мл продукта добавить 9 мл воды очищенной, 1 – 2 капли фенолфталеина, тщательно перемешать и протитровать 0,1 н раствором натрия гидроксида до перехода розового цвета в красный, который дает молочнокислое железо.

Кислотность продукта выражают в градусах Тернера и в процентах молочной кислоты. Градусом Тернера называется количество 0,1 н раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование 100 мл субстрата.

Грамм-эквивалент молочной кислоты равен 90. Следовательно, 1 мл 0,1 н раствора натрия гидроксида соответствует 9 мг молочной кислоты.

Исходя из результатов титрования, определить кислотность молочного продукта и процент молочной кислоты в нем.

Вариант 2. Получение гранул с лактобактериями, иммобилизованными в ацетилфталилцеллюлозе методом диспергирования с выделением фазы полимера из реакционной среды.

Бактериальная биомасса в жидких суспензиях иммобилизуется ацетилфталил целлюлозой с последующим частичным удалением жидкости и вакуумной сушкой иммобилизованной биомассы. В результате получается микрогранулированный негигроскопичный стабильный ацидорезистентный препарат, содержащий живые бактерии.

Для иммобилизации биомассы в 1 объемной части (50 мл) 10 %-ного раствора ацетилфталилцеллюлозы в водном растворе натрия гидрокарбоната вливают 2 объемные части (100 мл) жидкой суспензии бактерий при постоянном перемешивании, что соответствует соотношению 1: 1 по сухому остатку. Затем снижают рН до 5,0 добавлением соляной кислоты (около 80 капель). При этом образуется микрогранулы ацетилфталилцеллюлозы, содержащие живые бактерии. При оптимальном соотношении ацетилфталилцеллюлозы с сухим остатком суспензии 1: 1 в надосадочной жидкостиостается не более 1 % от исходного количества бактерий.

Увеличение количества ацетилфталилцеллюлозы практически не изменяет этот процесс, поэтому повышение относительного количества ацетилфталилцеллюлозы нецелесообразно, а при меньшем содержании ацетилфталилцеллюлозы этот процент значительно увеличивается. Образовавшиеся микрогранулы отделяют от жидкости фильтрованием через бумажный фильтр и сушат под вакуумом в течение 2 – 8 часов до остаточной влажности 4 – 8 %, т.к. при более высокой влажности материал обладает плохой сыпучестью. Полученные микрогранулы можно использовать в качестве самостоятельной лекарственной формы или для изготовления других лекарственных форм, например, капсул и т.п.

Техника выполнения работы.

1. Приготовление 10 % раствора ацетилфталилцеллюлозы.

2. Диспергирование бактериальной суспензии в растворе ацетилфталилцеллюлозы: для чего следует поместить в реакционный стакан 50 мл раствора ацетилфталилцеллюлозы, установить и отрегулировать мешалку (около 1000 об/мин, т.е. образование крутой воронки жидкости без образования пены) и, наконец, добавить тонкой направленной струйкой 100 мл бактериальной суспензии.

3. Выделение пленкообразующей фазы из раствора и обволакивание частиц суспензии пленкой ацетилфталилцеллюлозы, формирование гранул за счет медленного добавления (по каплям) 8,3 % раствора соляной кислоты до рН 5 (приблизительно 80 капель) по универсальной индикаторной бумаге.

4. Отделение гранул от жидкости путем фильтрации через нутч-фильтр.

5. Сушка гранул: в вакуум-сушильном шкафу при 37 С до остаточной влажности 8 %.

6. Оценка качества гранул: внешний вид, количество жизнеспособных бактерий в 0,1 г.

Вариант 3. Приготовление суппозиториев с лактобактерином методом выливания.

Суппозитории с лактобактерином представляют собой дозированную лекарственную форму, областью применения которой в основном является акушерско-гинекологическая практика, в частности она используется для профилактики кандидозов и восстановления нормальной сапрофитной микрофлоры слизистой.

Данную лекарственную форму можно рассматривать как один из способов иммобилизации бактериальных клеток.

К преимуществам данной лекарственной формы относится: удобство в применении, возможность ее стандартизации, точность дозирования, стабильность при хранении.

Расчеты. Приготовить 5 суппозиториев с лактобактерином.

№ п/п	Наименование компонентов	Количество ингредиента на 1 суппозиторий, г	Количество ингредиента на 5 суппозиториев, г
1	Бактериальная суспензия лактобацилл (1000 микроорганизмов/мл)	0,25	1,25
2	Эмульгатор Т-2	0,09	0,45
3	Витепсол	2,16	10,8
	Итого	2,5	12.5

Техника выполнения работы.

1. Приготовление основы: расплавить в выпарительной чашке эмульгатор Т-2 и затем витепсол, поместить во флакон.

2. Стерилизация основы при 180 С в течение 20 мин.

3. Приготовление суппозиторной массы: для этого при максимальном соблюдении санитарно-гигиенических требований полуохлажденную основу (45 С) внести частями в ступку с бактериальной суспензией и тщательно диспергировать до получения однородной массы.

4. Выливание суппозиториев: суппозиторную массу выливают в формы, не затягивая процесс заливки. Форму предварительно охлаждают в холодильнике в течение 15 мин.

5. Упаковка суппозиториев: форму разъединяют, отделяют от формы суппозитории и заворачивают в капсулы из вощеной бумаги. Упаковывают в коробку. Оформляют этикетку.

6. Оценка качества суппозиториев: 1 суппозиторий должен содержать от10000 до 1000000000 антагонистически активных штаммов микроорганизма. Данный показатель определяется путем посева на питательные среды и последующего подсчета числа выросших колоний. Контроль общих критериев качества проводится в соответствии с указаниями ГФ ХI издания.

Литература:

1. Бабин В.Н., Домараданский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры. – М.: ММА им И.М. Сеченова – 2003.

2. Байбаков В.И. Дисбактериоз – проблема эндоэкологическая.// «Химия и жизнь» - 2003.

3. Баранов А.А., Гринина О.В. Болезни органов пищеварения у детей. Принципы профилактики и медицинского обслуживания. – Горький: Волго-Вятское книжное издательство – 1981.

4. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. – 2-е изд., перераб. И доп. – М.: Медицина. – 1989.

5. Лекционный материал по биотехнологии.

6. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. Гурина С.В., Потехина Т.С., Елинова Н.Н. – СПб.: СПХФА. – 1997.

7. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

8. Хавкин А.И., Бельмер С.И., Волынец Г.В., Жихарева Н.С. Функциональные заболевания пищеварительного тракта у детей. Принципы рациональной терапии: Практическое руководство. – М.: НИИ педиатрии и детской хирургии. – 2003.

Темы рефератов.

1. Общие проблемы микроэкологии человека.

2. Нормофлоры в борьбе с дисбактериозом.

3. Аспекты биотехнологического получения монопрепаратов нормофлоров.

4. Перспективы биотехнологического получения препаратов на основе смешенных культур.

5. Перспективы получения биопрепаратов с помощью технологии иммобилизации ферментов или целых клеток.

25