6.1. Основные группы ферментов, используемые для получения аминокислот.

:

1. Гидролитические ферменты (гидролазы), например L-α-капролактамлиаза (для синтеза L-лизина). Для того чтобы можно было использовать неочищенные ферменты, в частности гидролазы, целые клетки обрабатывают ПАВ, вызывающими изменение их проницаемости. Разработаны также пути получения мутантов, у которых искомый продукт не вовлекается более в обмен веществ.

2. Лиазы используют в основном в реакциях дезаминирования, например, для образования L-аспартата из фумарата аммония может использоваться аспартаза или L-аспартат-аммиак-лиаза.

3. Ферменты, содержащие пиридоксальфосфат: участвуют в процессах метаболизма аминокислот, так как они катализируют такие реакции, как рацемизацию, трансаминирование, реакции замещения и элиминации, декарбоксилирования и являются универсальными. По-видимому, роль этих коферментов состоит в активации аминокислот. Например, L-тирозин-фенол-лиаза (β-тирозиназа) катализирует реакцию β-элиминации, в которой тирозин распадается с образованием пирувата, фенола и аммиака. При оптимальных условияхErwiniaherbicolaможет синтезировать большое количество этого фермента (до 10 % растворимого белка). Его используют для синтеза в основном в иммобилизованной форме, что является важным условием для осуществления непрерывного производства. Субстратная специфичность этого фермента такова, что он может осуществить реакцию β-замещения между Д,L-серином и пирокатехолом, в результате которой образуетсяL-ДОФА.

4. Дегидрогеназы аминокислот, например лейцин– и аланиндегидрогеназы. Эти ферменты катализируют обратимые реакции дезаминирования. Их применяют в непрерывных процессах синтеза аминокислот из соответствующих кетоаналогов.

5. Глутаминсинтетаза– этот фермент катализирует АТФ-зависимую реакцию аминирования глутамата, сопряженную со сбраживанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся при брожении энергия используется для синтеза глутамина. При использовании бесклеточного экстракта пекарских дрожжей и глутаминсинтетазы из глюкозы, глутамата и ионов аммония в качестве субстрата с высоким выходом был получен глутамин.

6. Получение аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов.

Все аминокислоты усваиваются только в L-форме, попадание в организмD-формы нежелательно.

L- и D-формы – энантиомеры, разновидность изомеров, являющихся зеркальными отражениями друг друга. СмесьL- и D-форм в равных соотношениях называют рацемической. Ей присущи все свойства чистого вещества,L- и D-изомеры во всех отношениях идентичны, кроме тех случаев, когда они вступают во взаимодействие с другим асимметрическим объектом.

Химический синтез всех аминокислот – давно решенная, несложная задача, но химические методы дают всегда рацемическую смесь аминокислот и, следовательно, необходима дополнительная стадия разделения энантиомеров. Чисто химически это сделать очень трудно. В то же время ферменты способны «узнавать», а значит и по-разному реагировать на L- иD-формы аминокислот или их производные. Преимущественное расщепление одного из энантиомеров под действием ферментов настолько предпочтительно, что, как правило, они быстро реагируют сL-изомером, совершенно не затрагиваетD-изомер. Это обстоятельство, т.е. энантиоселективность было положено в основу ферментативного разделения рацемических смесей аминокислот.

Промышленный процесс выглядит следующим образом: исходными веществами служат модифицированные по аминогруппе D, L-аминокислоты, полученные в процессе химического синтеза. На эту смесь воздействуют иммобилизованной аминоацилазой. Фермент гидролизует амидную связь толькоL-изомера. В результате образуется свободнаяL-аминокислота, обладающая более высокой растворимостью, чем ацильное производное. Образовавшуюся смесь свободнойL-аминокислоты и ацилированнойD-аминокислоты разделяют простыми физическими методами, основанными на их различной растворимости. Оставшийся после разделенияD-изомер обычно при повышенной температуре рацемизируют, т.е. превращают в исходнуюD,L-смесь и снова пускают в реакцию с ацилазой. В результате добиваются высокой концентрацииL-аминокислоты. Фермент аминоацилаза мало чувствителен к типу аминокислоты и поэтому одна установка с иммобилизованным ферментом может использоваться для получения самых разнообразныхL-аминокислот.

Иммобилизацию аминоацилазы проводят адсорбцией на специально подобранном полимерном носителе. Когда ее активность падает, в реактор добавляют свежую порцию фермента (один раз в несколько месяцев), которая тут же адсорбируется на носителе.

Теперь остановимся на рассмотрении возможностей практического использования иммобилизованных ферментов для получения отдельных аминокислот.

Промышленность в больших количествах производит L-аспарагиновую кислоту, которую широко применяют в пищевом производстве в качестве вкусовой добавки. Для синтеза данной аминокислоты разработан одностадийный ферментативный процесс, основанный на реакции присоединения аммиака к двойной связи фумаровой кислоты:

транс-НООССН=СНСООН + NH₃→L-НООССН₂С(NH₂)НСООН.

Данная реакция катализируется ферментом аспартазой. В качестве основного продукта с выходом, близким к 100 %, получают L-аспарагиновую кислоту. Катализаторами служат иммобилизованные в геле клетки. При ферментативном синтезе в отличие от химического энантиоселективность катализатора позволяет прямо в ходе синтеза продукта получать один нужный изомер вместо рацемата.

Два выше рассмотренных нами процесса уже реализовано на практике, а несколько перспективных технологий находятся на стадии полупромышленной и лабораторной разработки. Приведем некоторые примеры.

L-тирозинможно получить в результате обратимой реакции конденсации фенола, аммиака и пировиноградной кислоты. В качестве катализатора используют иммобилизованные клетки, содержащие тирозинфеноллиазу. В связи с обратимостью реакции невозможно достичь выхода продукта выше 70 – 90 %. Процесс ведут таким образом, что продукт,L-тирозин, обладающий низкой растворимостью, отделяют фильтрованием, а не прореагировавшие исходные вещества возвращаются повторно в цикл.

Если вместо фенола ввести в реакцию пирокатехин (1,2-диоксибензол), то продуктом окажется L-диоксифенилаланин (ДОФА). Эта аминокислота – лекарство от болезни Паркинсона, и поэтому требуется в больших количествах. ДОФА очень чувствительна к кислороду воздуха, поэтому ее получение химическими методами, а также выделением из природного сырья характеризуется низким выходом. Ферментативный синтез происходит быстрее в мягких условиях и дает более чистый продукт.

Альтернативный путь получения ДОФА – это гидроксилирование L-тирозина в присутствии фермента тирозиназы:

L-тирозин + 0,5О₂→ L-ДОФА.

Но в данном случае, встречается довольно характерная трудность, связанная с механизмом действия оксигеназ, к которым относится и тирозиназа, а также целый ряд других, так называемых кофакторных ферментов. Дело в том, что при функционировании этих ферментов расходуется дополнительное вещество – кофактор. В этом случае – это тетрагидроптеридин, который в ходе реакции окисляется, и, следовательно, требуется какой-то дополнительный процесс для регенерации кофактора.

В реакциях получения тирозина можно использовать не только фенолы, но и другие гетероциклы. Например, при введении индола в присутствии триптофаназы получается триптофан:

Индол + СН₃С(О)СООН +NH₃→L-триптофан.

Наконец, отметим еще два процесса, основанных на ферментативных превращениях легкодоступных химически циклических соединениях. Одно из них, α-аминокапролактам, подвергаясь гидролизу под действием α-аминокапролактамгидролазы, даетL-лизин иD-,L-аминокапролактам. Последний рацемизуют либо химически, либо ферментативно и вновь подвергают энантиоселективному гидролизу.

Второй процесс основан на гидролизе пятизамещенных гидантоинов. Гидантоины получают конденсацией альдегидов с КСNи (NH₂)CO₃. Для них характерна очень легкая рацемизация. Фермент гидантоиназа гидролизует только D-изомер (один из редких способов получения D-аминокислот), в нашем случае до D-,L-аминофенилуксусной кислоты, необходимой для синтеза некоторых антибиотиков, а оставшийсяL-изомер быстро рацемизуется и таким образом, в конечном счете, получаетсяL-аминокислота с высоким выходом.

Задание 2. Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Определение экзоаминокислот, продуцируемых культуройPseudomonasaeruginosa.

1. Вырастить колонию культуры Pseudomonasaeruginosaна чашках Петри с мясопептонным агаром и глицериновой средой.

2. Приготовить 2 мл взвеси по 1 млрд. стандарту, засеять в пробирку с жидкой питательной средой (10 % взвеси от объема питательной среды) и инкубировать 48 ч при28 °С.

3. Содержимое пробирки с выращенной культуральной жидкостью псевдомонаса нагреть на спиртовой горелке до 100 °С и кипятить 2 – 3 мин для того, чтобы убить микроорганизм. Надосадочную жидкость в количестве 0,005 – 0,01 мл (2 касания тонким капилляром) нанести на пластинку для тонкослойной хроматографии. Рядом нанести капилляром (1 касание) смесь «свидетелей» аминокислот, состоящую из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина. Пластинку высушить в токе теплого воздуха, под вентилятором и поместить в закрывающуюся емкость, где находится система растворителей: хлороформ-этилацетат – 32 % уксусная кислота в соотношении 60: 45: 10 или н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода очищенная (40: 15: 5). Пропустить подвижную систему растворителей через пластину в течение 20 – 30 мин. Затем пластину вынуть из емкости, высушить в токе теплого воздуха и погрузить на 0,5 – 1,0 мин в 0,1 % раствор нингидрина в ацетате («проявитель»), высушить в токе теплого воздуха и нагреть пластины при 100°С в течение 5 – 10 мин.

Аминокислоты проявляются на пластинах в виде пятен сине-фиолетового цвета. Идентификацию аминокислот на хроматограмме осуществляют путем сравнения пятен, образованных из смеси свидетелей, с положением пятен аминокислот в культуральной жидкости.

Вариант 2. Ознакомиться с важнейшей реакцией тканевого метаболизма аминокислот – трансаминированием и освоить колориметрический метод определения ферментов аминотрансфераз, катализирующих эту реакцию.

В процессе трансаминирования, происходящего под действием аспартат-аминотрансферазы (АсТ) и аланин-аминотрансферазы (АлТ), образуются щавелевоуксусная и пировиноградная кислоты. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина (2,4 ДНФГ) процесс трансаминирования останавливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты, имеющий в щелочной среде красноватую окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

АсТ катализирует реакцию:

АсТ

Аспарагиновая +-кетоглутаровая Глутаминовая + щавелевоуксусная

кислота кислота кислота кислота

АлТ катализирует реакцию:

АсЛ

-аланин +-кетоглутаровая Глутаминовая + Пировиноградная

кислота кислота кислота

Пировиноградная + 2,4-ДНФГ 2,4-ДНФ гидразон + Вода.

кислота (ПВК) ПВК

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Техника выполнения лабораторной работы. В две пробирки добавляют по 0,5 мл субстратного раствора, предварительно подогретого в термостате при 37С в течение 5 мин. В одну из них (опытную) вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл воды. Необходимо следить за тем, чтобы в сыворотке не было гемолизата. Дальнейший ход исследования приведен в таблице.

Ход определения активности АсТ и АлТ.

№ п/п	Операции	Опытная проба	Контрольная проба
1	Берут субстратный раствор, мл	0,5	0,5
2	Добавляют сыворотку, мл	0,1	-
3	Добавляют воду, мл	-	0,1
4	Инкубируют при 37 С для АсТ – 60 мин для АлТ – 30 мин
5	Добавляют 2,4-ДНФГ, мл	0,5	0,5
6	Выдерживают при комнатной температуре 15 мин
7	Добавляют едкий натр 0,4 н раствор, мл	5,0	5,0
8	Выдерживают при комнатной температуре 10 мин
9	Колориметрируют, светофильтр зеленый, кювета 10 мм	Е	-
10	Производят расчет

Расчет. Активность АсТ и АлТ выражают числом единиц фермента в 1 мл сыворотки. За единицу принимают такое количество фермента, которое образует 1 мкг пировиноградной кислоты при указанных выше условиях.

Расчет проводят по формуле:

Активность аминотрансферазы = а*10, [ед.],

где а – количество мкг пировиноградной кислоты, найденное по калибровочному графику;

10 – пересчет на 1 мл сыворотки.

В сыворотке здоровых людей содержание АсТ, найденное этим методом, колеблется в пределах 8 – 40 ед., а содержание АлТ – в пределах 5 – 30 ед.

Активность ферментов выражают в мкМ пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 ч при 37 С.

Расчет проводят по формуле:

АсТ = (а*10)/88,

АлТ = (а*2*10)/88,

где а – количество мкг пировиноградной кислоты, найденное по калибровочному графику;

88 – вес 1 мкМ пировиноградной кислоты, мкг;

2 – пересчет на 1 час инкубации;

10 – пересчет на 1 мл сыворотки.

Активность АсТ в норме составляет 0,1 – 0,45 мкМ пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 С, активность АлТ – 0,1 – 0,68.

Практическая значимость работы. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет исключительно важное значение для диагностики заболеваний печени и сердца. Повышение активности этих ферментов наблюдается уже в ранний инкубационный период вирусного гепатита, что имеет принципиальное эпидемиологическое значение для выявления больного еще до появления клинических признаков. Увеличение активности аминотрансфераз наблюдается также при инфаркте миокарда, при этом степень повышения отражает массивность поражений сердечной мышцы и тяжесть инфаркта.

Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. Комов В.П., Шведова В.Н., Кириллова Н.В., Спасенкова О.М., Фирсова В.И., Троицкая Л.А. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

Лекционный материал по биотехнологии.

5. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. С.В. Гурина, Т.С. Потехина, Н.Н. Елинова. – СПб.: СПХФА. – 1997.

6. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.

7. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.

8. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

Темы рефератов.

1. Регуляция и усвоение азотсодержащих соединений.

2. Общие принципы конструирования штаммов микроорганизмов-продуцентов аминокислот как первичных метаболитов.

3. Основные пути регуляции биосинтеза аминокислот.

4. Способы интенсификации процесса биосинтеза аминокислот.

5. Перспективы биотехнологического производства глутаминовой кислоты.

6. Перспективы биотехнологического производства треонина.

7. Перспективы получения аминокислот с использованием иммобилизованных клеток и ферментов.