4.1. Подготовка посевного материала.

4.1.1. Подготовка экспланта.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности, т.к. богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растений фрагменты (экспланты) легко подвержены микробной контаминации, следовательно, стерилизации должны подвергаться и экспланты, и питательные среды.

Стерилизацию экспланта, а такжесемянпроводят путем их выдерживания в течение 5-20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации во многом зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Обычно семена стерилизуют 10-20 мин, а вегетативные части – 5-10 мин. Органы растений, из которых берут эксплант, предварительно моют мыльным раствором с щеткой и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70 % этанол. Семена погружают в спирт на 1-2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед погружением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего.

После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой.

4.1.2. Подготовка посевного материала.

Подготовка посевного материала – одна из ответственных стадий биотехнологического производства БАВ.

Культуру ткани (коллекцию культуры) завода получают из академий и университетов. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения.

Для твердофазного метода культуру ткани выращивают на агаризованной стерильной питательной среде в колбах вместимостью 0,25 л в термостатируемом помещении или термостате с температурой 271С. На 38 – 46 сут. роста материнской культуры режут таким образом, чтобы инокуллюм состоял из вертикального столба (верхний слой, средний и часть нижнего слоя безагаризованной среды). Нельзя допускать воздействия на культуру дезсредств, бактерицидных ламп, т.к. это ведет к инактивации роста. Из одной материнской культуры пересаживают 7 – 9 дочерних культур и через 38 – 49 сут. роста в термостатируемом помещении отбирают колбы с культурами тканей лучших ростовых признаков. Для таких культур характерны быстрый рост, максимальное использование питательной среды, цвет ткани от светло-желтого до молочного, отсутствие некротических включений.

Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани предварительно выращивают на агаризованной стерильной среде в пробирке, затем из пробирок высевают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации глубинного выращивания на качалках в течение 38 – 46 сут. для каждой генерации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор, затем хорошо развивающуюся культуру переносят в основной ферментер. Для посева в основном ферментере используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята).