10. Культура клеточных суспензий.

Для суспензионных культур исходным материалом могут быть как изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллус. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постоянном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит существенно быстрее, чем каллусной культуры, т.к. скопления клеток поглощают питательные вещества значительно больше общей поверхностью, а у каллуса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образовываться способный к жизни каллус. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которые после их переноса на агар образуют новое растение.

При получении суспензионной культуры непосредственно из ткани экспланта используют ферменты, чаще всего пектиназу.Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспендирование, для чего в питательную среду и вводят фермент пектиназу, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки. Также рекомендуется использовать среды, содержащие 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы кальция. В данном случае агрегаты клеток не образуются.

Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через сита (металлические, нейлоновые), чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки экспланта. На образование клеточных агрегатов также оказывает влияние интенсивность перемешивания среды, т.к. клетки очень чувствительны и быстро лизируются. Большинство клеток погибают.

Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии в питательной среде фитогормонов, т.е. суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, с присущими для клеток такого рода свойствами.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса.

Направления использования клеточных суспензий.

Клеточные суспензии используют в биотехнологии для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами; для промышленного выращивания клеточнойбиомассыи дляклеточной селекции; кроме того, суспензии клеток используют для полученияизолированных протопластов, а также для полученияновых необычных соединений (например, камптотецина, харрингтонина-антиканцерогены; пептиды).

При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных метаболитовприменяют открытые или закрытые системы ферментеров периодического и непрерывного действия, как правило, работающие в хемостатном режиме. В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания; в случае же открытых систем, работающих в режиме непрерывного культивирования питательная среда непрерывно меняется на свежую. Как при периодическом, так и при непрерывном режимах культивирования в открытых системах клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене, но в таких системах при замене питательной среды на новую вместе со старой средой отбирается и часть суспензионной культуры. Культивирование клеточных суспензий с целью получения вторичных метаболитов осуществляют в ферментерах большого объема (до 20000л и больше) в режиме глубинного культивирования в закрытых периодических системах. Аэрацию культуральной биомассы осуществляют стерильным воздухом через барботер. Воздух стерилизуют путем фильтрации.

В ходе культивирования клеток растений регулируют температуру (25 – 37 С), рН и окислительно-восстановительный потенциал. Процесс культивирования ведут до тех пор, пока идет интенсивный синтез целевого продукта и в среде не будут исчерпаны питательные вещества. При определении окончания процесса культивирования необходимо учитывать данные микроскопического контроля состояния культуры, отсутствие посторонней микрофлоры, концентрацию основных питательных веществ, биомассы, целевого продукта, рН. Культивирование растительных клеток и тканей сопряжено с повышенными требованиями к обеспечению асептических условий.

Основные характеристики суспензионных культур.

Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителями (метиленовой синью или синью Эванса). Живые клетки не окрашиваются вследствие непроницаемости для красителя клеточных мембран. В мертвые клетки краситель легко проникает, следовательно, они окрашиваются в синий цвет.

Плотность клеточных суспензий:число клеток суспензии определяется микроскопическим методом с помощью счетной камеры Фукса-Розенталя после предварительной мацерации (разделения клеток). В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту (10-20 %-ная), которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки.

Ростовая кривая: хорошо растущая суспензия имеет s-образный характер ростовой кривой. Длительность каждого пассажа составляет 14 – 16 дней. Основными критериями роста суспензионной культуры является: увеличение (прирост) числа клеток, а также их сухой и сырой массы.

Степень агрегативности клеток: агрегаты должны содержать не более 10-12 клеток, а для того чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры, что позволяет, кроме того, освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.