1.5 Технология получения
Ретинол–это циклический, непредельный, одноатомный спирт. Образуется в кишечнике и печени из провитаминов (альфа-, бета-, и гамма-каротины) под действием фермента каротиндиоксигеназы до альдегидной формы ретинола – ретиналя (альфа- и гамма-каротины расщепляются с образованием 1 молекулы, а бета-каротин - 2молекулы ретиналя). Далее фермент алкогольдегидрогеназа переводит ретиналь в ретинол.
Каротиноиды - пигменты,их много в вывсших растениях, водорослях, в клетках некоторых микроорганизмов; животные организмы их не синтезируют.
Бета- каротина много содержится в моркови,тыкве,облепихе, люцерне, салате, черной смородине,чернике,крыжовнике,персиках,абрикосах и др.
Среди микроорганизмов бета-каротин синтезирует фототрофы, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи.
Основной продуцент Blakesleatrispora (+) b (-) штаммы.
К примеру, 1г моркови содержит 60мкг бетакаротина; при культивировании B.trispora 1 г биомассы содержит 3-8 тыс.мкг провитамина.
Промышленное производство ретинола осуществляется микробиологическим и химическим синтезами.
Микробиологический синтез основан на использовании B.trisporaв качестве субстрата применяется пшеничная или рисовая мука, растительное масло (хлопковое,кукурузное или подсолнчное). Вносят стимуляторы синтеза бета-каротина В-ионон цитрусовая меласса, а так тжетиамин.Свет усиливает выход этого пигмента.
Стадии выделения целевого продукта витамина А существенно различается в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт отчистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экстретируется) продуцентом культуральной жидкости
Первым этапом на пути к очистке витамина является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Иногда сепарация предшествует специальная обработка культуры – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белка. Существуют различные методы сепарации: флотация, фильтрация, центрифугирование. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации. Наиболее перспективной для осаждения биомассы содержащей витамин являются центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждается на стенки вращаемого цилиндра.
Вторым этапом на пути к отчистки целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграция) проводят физическим, химическим, химико-ферментативными методами.
Наиболее индустриальное значение имеет физическое разрушение:
1) ультразвуком;
2) с помощью вращающихся лопастей и вибраторов- метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках;
3)встряхиванием со стеклянными бусами;
4)Продавливание через узкое отверстие под высоким давлением
5) раздавливание замороженной клеточной массы;
6)растиранием ступки
7)осмотическим шоком
8)замораживание-оттаиванием
9)сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия)
Физические способы разрушения более экономичны, чем химические, химико-ферментативные.
Осторожны и избирательное разрушение клеточной стенки возможно, при использовании химический и химико-ферментативных методах:
Лизис клеток антибиотиками, некоторые поверхностно активными веществами, а так же глицином; автолиза клеток при лимитированном по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагами.
Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции.
Осаждение растворенных веществ возможно физическими (нагреванием, охлаждением, разбавление или концентрирование раствора) или химическими воздействиями, переводящими отделяемый продукт в малорастворимое состояние.
Экстракцию можно подразделить на твердо-жидкофазную, при которой из твердой фазы переходит в жидкую и жидко-жидкофазную перевод продукта из одной жидкой фазы в другую
К твердо-жидкофазной экстракции относится простое обливание твердого образца водой с целью извлечения из него растворимых веществ, например, солей металлов из руд, подвергнутых бактериальной обработке, или растворимых продуктов из массы субстрата при твердофазном культивировании.
Жидко-жидкофазная экстракция органическим растворителям часто применяются для извлечения из культуральной жидкости антибиотиков, витаминов, каратиноидов, липидов, некоторых гидрофобных белков.
Полностью избежать нагревание, губительно для многих ценных веществ позволяют методы холодовой экстракции (криоэкстракция). Криоэкстракция осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находящимися при комнатной температуре в газообразном состоянии
Для экстракции неполярных органических соединений можно использовать жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном нагревании до нуля градуса Цельсия кипящей растворитель улетучивается, и продукт остае6тся в чистом виде. Криоэкстракция может использоваться в комбинации с криоконсервацией клеток. [8]
Адсорбция – экстракции, при которой экстрагирующим агентом является твердое тело. Оно заключается в связывании вещества поверхностью твердого т ела из жидкой или газовой фазы. Традиционно применяемыми адсорбентами являются древесный уголь.
Лиофилизация
Высушивание материала проводится в лиофильных установках при следующем режиме: замораживание содержимого ампул или флаконов до температуры в материалах не выше 55° С проводят в течение от 2 до 3 часов. Значение вакуума в период сублимации и досушивания колеблется в пределах от 4 до 7 Па. После чего включают обогрев полок и доводят постепенно температуру до 40°С. Время лиофилизации при минусовых температурах в материале колеблется в пределах от 12 до 16 часов при температуре выше 0° С от 10 до 14 часов. Время досушивания препарата до температуры в материале от 18° С до 25° С составляет от 4 до 6 часов, при температуре обогрева полок не выше 35. [9]
После окончания высушивания ампулы и флаконы запаивают под вакуумом. Запаянные вакуумы и закрытые флаконы проверяют визуально на отсутствие трещин. Все ампулы с вакциной проверяются на вакуум. Остаточная влажность споровой массы в ампулах не должна превышать 2,5%.
Схема 1. Технология приготовления витамина А
На схеме 1 показано что, раздельно готовится посевной материал из (-) и (+) штаммов В-trispora, их смешивают в биореакторе, непосредственно перед ферментацией. Соотношение (-) и (+) штаммов 1/15, т.е. мужской формы (-) пятнадцатикратный избыток. При слиянии разнополого женского (+) и мужского (-) мицелия образуется зигота, которая синтезирует в 5-17 раз больше бета-каротина, чем каждый штамм в отдельности. Ферментация сопровождается аэрацией и перемешиванием. Накопление бета-каротина наблюдается во второй фазе развития, после прекращения роста мицелия. В культуральной среде уменьшается концентрация липидов вследствие их активной переработки в бета-каротин. Концентрация последнего достигает 2000 мг/л.
По окончании ферментации биомасса сепарируется, подвергается распылительной сушке до 7% остаточной влаги. Далее в зависимости от назначения, цели применяют технологии различаются:
1. После сушки порошок смешивается с наполнителем и гранулируется, применяется в качестве кормового концентрата;
2. Экстрагируется маслом, концентрируется ,промывается этанолом, получают каротин в масле (подсолнечное или другое) с содержанием 2,0-2,5 г/кг провитамина, применяет как пищевую добавку к хлебу, маслу;
3. Кристаллический бета-каротин – экстрагируют фреоном, очищают от органических примесей, получают кристаллы оранжево-красного цвета, применяют в медицинских целях
Заключение
Важное место в обмене веществ у животных занимает бета – каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животного каротины не образуются. Основные источники бета – каротина для животных – растительные корма; человек получает бета – каротин так же из продуктов животного происхождения. Бета – каротин можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны. В начале 60-х годов ХХ в. разработана схема микробиологического синтеза бета – каротина, которая стала основой промышленного способа его получения.
Список используемой литературы:
Л.П. НИКИТИНА, А.А. Савченко, Е.Н. Анисимова, А.Г. Борисов, А.Е. Кондаков. Витамины как основа Иммунометаболической терапии. — Красноярск.: КрасГМУ, 2011
Н.В. СОЛОВЬЕВА. КЛИНИЧЕСКАЯ ВИТАМИНОЛОГИЯ. — Чита, 2002.
В. А. Девятнин. Витамины. — М.: Пищепромиздат, 1948
Викторов А. П., Войтенко А. Г. Препараты витамина А в фокусе безопасности // Провизор : журнал. — 2008. — № 09.
Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии. М. Агропромиздат.1998.
Берек М.,Лиепиньш Р.М. Биотехнология.Агропромиздат. 1990
Ескендирова.С.З. Биотехнология микроорганизмов УМК Астана 2003
Кухар Е.В., Сураншиев Ж.А. УМК Биотехнология микроорганизмов. Астана 2008
Егоров Н.С.,Самуилов В.Д. Биотехнология.Высшая школа,1998
Тихонов И.В.,Воронин Е.С. Основы биотехнологических процессов. Москва,2000
http://bibliofond.ru/
Приложение
Приложение № 1
Структура ретинола – химическое строение
Приложение № 2
Джордж Уолд - американский биохимик, получил Нобелевскую премию в 1967г, выяснив значения витамина А для зрения
Приложение № 3
Ретинола ацетат – препарат, содержащий витамин А.
Приложение № 4
Продукты, содержащие витамин А
