4. Фосфатазы. Киназы.

Фосфатаза (КФ 3.1.3.48) — фермент, который дефосфорилирует субстрат (как правило другой белок) в результате гидролиза сложноэфирной связи фосфорной кислоты. При этом образуется фосфатный анион и молекула продукта с гидроксильной группой. По своему каталитическому и физиологическому действию фосфатаза является антагонистом фосфорилазы и киназы, которые присоединяют фосфатную группу к субстрату.

Хотя белки являются наиболее распространённым субстратом фосфатаз, некоторые фосфатазы дефосфорилируют фосфорилированные липиды, сахара инуклеотиды. Например, фосфатаза PTEN специфически дефосфорилирует сигнальный липид фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат.

В зависимости от природы активной группы фермента фосфатазы делятся на два типа: цистеин-зависимые фосфатазы и металлофосфатазы. Типичным представителем группы фосфатаз является щелочная фосфатаза, широко используемая в диагностических и лабораторных целях.

Киназы

Киназы (протеинкиназы, фосфотрансферазы) - это особые специфичные ферменты, производящие фосфорилирование белка и тем самым поддерживющие и завершающие каскады внутриклеточных биохимических реакций.

Киназы переносят фосфатные группы с аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) на разные субстраты, преимущественно на гидроксильную группу спиртов, углеводов или аминокислот. Для работы всех киназ необходимо присутствие ионов магния (Mg²⁺), который служит связующим звеном между АТФ и белком.

Из всевозможных киназ с точки зрения мезанизмов пластичности синапсов нас интересует группа протеинкиназ, т.е. тех киназ, которые "пересаживают" фосфорные остатки с АТФ на белок. Тем самым они могут так изменить белок, что он начнёт работать совершенно не так, как работал раньше. Это уже и есть, собственно говоря, пластичность.

В результате киназного фосфорилирования происходит химическая модификация «рабочих» белков именно за счёт того, что с помощью киназы к определенным участкам этих белков присоединяются остатки фосфорной кислоты. В результате такие фосфорилированные белки меняют свои прежние свойства. Соответственно, меняются процессы, которые осуществляются этими «рабочими» белками. А вследствие этого – меняется состояние отдельной структуры, содержащей эти белки, или состояние всей клетки и её свойства. Киназы сажают фосфорные остатки не куда попало, а строго на предназначенные для них места. Каждый вид киназы имеет свою определённую мишень, т.е. киназы обладают специфичностью.

5 векторы на основе репликонов бактер плазмид

Вектор pBR322

был получен случайно, длина 4,36 тпн, имеет два селективных маркера устойчивости к ампицилину и тетрациклину, используется в подавляющем большинстве генно-инженерных работ, на основе pBR322 были сконструированы векторыpBR325 иpBR328, в составе которых появился маркер устойчивости к хлорамфениколу

Вектор pMB9

Создан на основе делеционного варианта ColE1, обозначенногоpMB8

-обладает геном иммунности к колицину, имеет один сайт EcoRI, в который перенесен ген устойчивости к тетрациклину плазмидыpSC101

-размер pMB9 - 5,3 тпн

-маркеры:-устойчивость к тетрациклину,-иммунитет к колицину

-недостаток - тест на колицин ненадежен

Вектор pBR313

Входит в серию плазмид pBRсозданных в лаборатории Х. Бойера в 1977-1980 гг.содержит единичные сайты рестрикции: -EcoRI,HindIII,BamHI,SalI,XmaI,SmaI,HpaI

-фенотипическая детекция осуществляется при клонировании по

-HindIII,BamHI,SalI,PstI– сайтам, при этом рекомбинантные клоны

могут быть отобраны по фенотипу устойчивость / чувствительность

к антибиотикам - ампицилину и тетрациклину