9.Получение библиотеки днк с помощью вирусных или плазмидных векторов.

Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.

Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

10.Получение библиотек кднк из отобранных популяций мРнк

Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.

Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

11.Выявление нужных клонов в генной библиотеке путем гибридизации с радиоактивным днк-зондом.

Нужную нуклеотидную последовательность в образце ДНК можно обнаружить с помощью ДНК-зонда, спаривающегося только с искомой последовательностью. Для этого ДНК сначала переводят в одноцепочечную форму, подвергнув ее тепловой обработке или воздействию щелочью. В этих условиях водородные связи между основаниями разрываются и цепи расходятся

Этот метод широко применяется для локализации радиоактивного материала в клетке, срезе ткани или на пластине геля после электрофореза смеси макромолекул. Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. «Засвеченные» участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. Одним из вариантов радиоавтографии является флюорография. В этом случае в исследуемый образец импрегнируют сцинтиллятор и вновь накладывают рентгеновскую пленку. Метод основан на том, что низкоэнергетические Р-частицы, образующиеся при распаде изотопа (например, трития), взаимодействуют с молекулами сцинтиллятора, при этом энергия радиоактивного распада преобразуется в световую энергию, которая и регистрируется рентгеновской пленкой, чувствительной к синей области спектра. Все операции при радиоавтографии необходимо проводить в темноте, чтобы не засветить пленку.

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блотгинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают денатурации и фиксируют, а затем проводят гибридизацию с радиоактивным ДНК-зондом. Гибридизационный сигнал регистрируют радиоавтографическими методами.

Процедура ДНК-гибридизации состоит в следующем. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо «пришивают» к твердой подложке (нитроцеллюлоз-ному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.11). Гибридные молекулы можно визуализировать радиоавтографическим (дополнение 4.2) или другим методом, зависящим от природы метки. Если комплементарность между зондом и ДНК-мишенью отсутствует, то гибридизации не происходит, и мы получаем отрицательный результат. Обычно размер зонда варьирует от 100 до 1000 п. н. и более, хотя можно использовать как более крупные зонды, так и зонды меньшего размера. Для гибридизации, т. е. для образования стабильного комплекса, необходимо, чтобы на участке длиной 50 нуклеотидов совпадало более 80% из них, но это зависит от условий реакции.

Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами. Один из них, называемый методом случайных праймеров, основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. Некоторые из этих олигонуклеотидов оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мишени и гибридизуются с ними, если ДНК предварительно денатурировать (рис. 4.12). После отжига олигонуклеотидов с денатурированной ДНК-мат-рицей в реакционную смесь добавляют четыре де-зоксирибонуклеотида (дезоксирибонуклеозид-трифосфаты; dNTP), один из них — меченый, и фрагмент ДНК полимеразы 1 Е. coli (фрагмент Кленова). Фрагмент Кленова обладает ДНК-по-лимеразной и З'-экзонуклеазной активностями, но не 5'-экзонуклеазной активностью, присущей ДНК-полимеразе I Е. coli, которая могла бы расщепить новосинтезированные молекулы ДНК. Одиночные цепи ДНК-мишени служат матрицами для синтеза новых молекул ДНК, а связанные с ними случайным образом олигонуклеотиды — затравками (рис. 4.12). При радиоактивном мечении один из dNTP содержит а-32Р, так что 32Р-мечен-ным оказывается и сам зонд. Радиоактивную метку выявляют с помощью радиоавтографии.

В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех dNTP. Для выявления гиоридизо-вавшегося биотинилированного зонда на фильтр наносят конъюгат стрептавидина с соответствующим ферментом (например, щелочной фосфатазой). Стрептавидин образует комплекс с биотином, который обнаруживается благодаря тому, что под действием фермента образуется окрашенное или люминесцирующее вещество — продукт превращения нанесенного на фильтр субстрата.

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК; это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК — источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.

12.ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация — иногда в миллионы раз — осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы: I) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень; их 3'-гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу; 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 000 п. н.; 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше; 4) четыре дезокси-рибонуклеотида.

Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следующих трех реакций.

1. Денатурация. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДНК выдерживанием его при температуре 95 °С в течение по крайней мере 1 мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерий Thermus aquati-cus, и четыре дезоксирибонуклеотида.

2. Ренатурация. Температуру смеси медленно понижают до ~55 °С, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностями ДНК.

3. Синтез. Температуру повышают до ~75 °С — величины, оптимальной для ДНК-полимеразы Taq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3'-гидроксильной группой праймера.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляются автоматически. Каждый цикл обычно длится 3—5 мин.

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представлять положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом раунде. В первом раунде каждая из новосинтезирован-ных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3'-гидроксильной группы «ее» праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют «длинными матрицами», именно на них будет идти дальнейший синтез (рис. 5.18).

Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной («длинная матрица») цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются «длинные матрицы», а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом («короткие матрицы») (рис. 5.19). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются (рис. 5.20). В последующих раундах «коротких матриц» становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 106 раз превышает число исходных цепей или «длинных» матриц (рис. 5.21).

Метод ПЦР получил широкое распространение. Разнообразные случаи его применения мы рассмотрим в последующих главах. Здесь упомянем лишь некоторые из них. Один из важнейших — идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений. С появлением ПЦР отпала необходимость в выделении и очистке ДНК-мишени; для анализа можно использовать очень небольшое количество неочищенного материала. Для синтеза праймеров, специфичных в отношении исключительно ДНК-мишени, нужно знать нуклеотидную последовательность ДНК предполагаемого патогенного микроорганизма. В этом случае в ходе ПЦР будет амплицициро-ваться только фрагмент ДНК, длина которого равна суммарной длине двух праймеров и фрагмента ДНК между ними.

ПЦР — высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшейиз одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.

Метод 11ЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продук-та. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по скольку полимераза Taq присоединяет к 3'-концу синтезируемой цепи лишний адениннуклео-тид, что снижает эффективность лигирования. Но если вектор для клонирования обработать рестрицирующей нуклеазой с образованием новых тупых концов и затем проинкубировать с полимеразой Taq в присутствии dTTP, то к обоим 3'-концам фрагментов добавится по одному тимидиннуклеотиду. Взаимной комплементарное™ концевых участков вектора и ПЦР-проду-кта протяженностью в один-единственный нуклеотид оказывается достаточно для спаривания молекул и их последующего лигирования.

13.Методы секвенирования ДНК.Использование нерадиоактивных меток при секвенировании.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс-минус" метод

Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов"

В 1977 г. автор "плюс-минус" метода предложил еще один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации

В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.

Автоматическое секвенирование ДНК

В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP (*). Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки.

Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке.

14.Конструирование делеций для секвенирования.Приготовление матриц для секвенирования ДНК

Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма, их используют для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых этими генами белков. Последовательное удаление участков ДНК на границах генов с помощью делеций оказалось плодотворным в обнаружении регуляторных элементов генов, исследовании их структурно- функциональных особенностей, взаимного расположения и влияния друг на друга.

Метод получения делеций любого размера разработан с использованием экзонуклеазы Bal31 для удаления нуклеотидов в окрестностях сайтов рестрикции ( рис. II.16 ).

Ген, клонированный в плазмиде , расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Bal31. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К "тупым" концам таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо посредством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки.

14.2. Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса.

Первые успехи в ферментативном секвениро-вании были достигнуты с природными одноцепочечными ДНК, такими как бактериофаги фХ17 и fl [Sanger et al., 1977a; 1973]. Значительные усилия, которые приходилось прикладывать экспериментаторам для получения одноцепочечных матриц ДНК, пригодных для секвенирования ферментативным методом, первое время сдерживали широкое распространение этого метода, поскольку время, затрачиваемое на их получение, являлось основной составляющей всего процесса. Так, в ранних экспериментах по секвенированию ДНК предлагалось клонирование представляющего интерес фрагмента в бактериофаге лямбда с последующим разделением цепей [Davies, 1982] путем весьма длительного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия с поли(U, G), известного достаточно давно [Szybalski et al., 1971]. Другим способом получения матриц для секвенирования, также основанном на делении цепей, но уже хроматографией, был путь клонирования фрагментов ДНК в специальном векторе рКН47, сконструированном на основе плазмиды pBR322, и содержащем поли(dA):поли(dT) дуплексный фрагмент протяженностью около 100 пн [Hayashi, 1980]. Это позволяло после денатурации плазмидной ДНК осуществлять достаточно эффективное разделение цепей клонированной вставки вместе с векторными последовательностями, одна из которых несла поли(dA)-, а другая - по-ли(dT)-участки на колонках с олиго(dT)- и олиго(dA)-целлюлозами соответственно.

Фаги f1, будучи не изометрическими, позволяют клонировать в них вставки чужеродной ДНК, однако их размер обычно не превышает 1 тпн ввиду нестабильности вставок большего размера. Созревание фаговых частиц сопровождается их выходом наружу в культуральную среду без лизиса бактериальной клетки. Поскольку ДНК в фаговых частицах представлена одиночной (+)-цепью, то и содержащаяся в рекомбинантных фагах вставка также будет одноцепочечной. Остается только собрать фаговые частицы и отделить от белка фаговую ДНК. После завершения этих процедур одноцепочечная матрица ДНК готова для секвенирования ферментативным методом. Детальное описание всего этого процесса изложено в многочисленных статьях [Messing et al., 1981; Messing, 1983; Sangeret al., 1980; Davies, 1982; Bankier, Barrell, 1983, 1989; Kristensen et al., 1987; Краев, 1988] и практических руководствах [Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989; Promega Guide, 1996]. Кроме этого, существует описание отдельных подходов, имеющих целью как-то усовершенствовать процедуры выращивания фага М13, выделения и очистки его одноцепочечной ДНК [Reddy, McKenney, 1996]. Довольно много статей посвящено автоматизации процесса выделения одноцепочечной ДНК фага М13 из большого числа фаговых бляшек, что имеет прямое отношение к автоматическим методам секвенирования ДНК и поэтому будет рассмотрено в соответствующем разделе.

15. Экспрессия белков E.coli.Оптимизация экспрессии белков с использованием регулируемых промоторов

Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов, используемых для продукции гетерологичных белков вследствие того, что она способна к быстрому росту до высоких концентраций на простых средах, ее генетика достаточно хорошо охарактеризована, доступен большой набор клонирующих и экспрессионных векторов и мутантных штаммов.Идеальный экспрессионный вектор должен обеспечивать высокий уровень синтеза продукта в случае индукции при минимально низком базовом уровне экспрессии, что необходимо, в первую очередь, при экспрессии продуктов, которые могут быть токсичны для клетки.Несмотря на это, большинство современных систем для синтеза гетерологичных белков в E. coli обладают относительно узким диапазоном регулирования. Так, например, диапазон регуляции синтеза продукта в коммерческой системе pQE фирмы Qiagen составляет всего 100-200 раз. Вследствие этого системы, обладающие низким базовым уровнем экспрессии, не позволяют достичь высокого уровня синтеза продукта при полной индукции, а системы с высоким максимальным уровнем имеют обычно и достаточно высокий базовый уровень экспрессии, что делает их мало пригодными для получения чужеродных полипептидных продуктов, которые могут быть токсичными для бактериальной клетки.

15.2.

Регуляция уровня синтеза целевого белка в существующих экспрессионных системах достигается за счет использования промоторов, уровень активности которых (т.е. количество актов инициации синтеза мРНК за единицу времени) может быть искусственно изменен, и/или путем изменения числа копий вектора, определяемого участком, который ответственен за репликацию.

А) Регулируемые промоторы

Большинство используемых промоторов для экспрессии генов в E. coli получены из грамм положительных бактерий и бактериофагов. Классическим примером регуляции экспрессии генов у прокариот в природе является лактозный оперон, поэтому именно его компоненты используются во многих регулируемых промоторах. Сам lac промотор, как и сходный с ним lacUV5, является достаточно слабым и редко используется для высокоэффективного синтеза продукта (Yanisch-Perron et al., 1985). Синтетические промоторы tac и trc, включающие (-35) район trp промотора и (-10) район lac промотора, являются значительно более сильными и обеспечивают уровни экспрессии до 15-30% общего клеточного белка (de Boer et al., 1983; Brosius et al., 1985). Такие промоторы контролируются репрессором лактозного оперона: синтез продукта достигается внесением в среду аналога лактозы IPTG. Сходную структуру и регуляцию имеет гибридный промотор Т5 в векторах серии pQE фирмы Qiagen.

Одной из альтернатив регуляции экспрессии является использование позднего промотора фага Т7 (Tabor and Richardson, 1985; векторы серии рЕТ фирмы Novagen), специфически транскрибируемого РНК полимеразой фага. При этом ген Т7 РНК-полимеразы клонируется in trans под контролем промотора lacUV5, индуцируемого IPTG. Хотя эта система обеспечивает уровни экспрессии до 30-50% общего белка (Baneyx, 1999), она не лишена недостатков. Например, высокие уровни мРНК могут вызывать деградацию рибосом, а базовый уровень экспрессии Т7 РНК полимеразы может приводить к нестабильности плазмиды (Miroux and Walker, 1996). Более того, даже «пустые» рЕТ векторы могут быть токсичны для клетки в присутствии IPTG (Miroux and Walker, 1996).

Общим же недостатком всех производных lac промотора следует считать достаточно высокий базовый уровень экспрессии, препятствующий высокоэффективной экспрессии белков, которые могут быть токсичны для клетки. Так, диапазон регуляции Plac промотора составляет всего 80-100 раз, что обуславливает достаточно высокий уровень его активности в отсутствие индуктора (Guzman et al., 1995, Yanisch-Perron et al., 1985). Эта проблема сохраняется и для векторов серии рЕТ, поскольку ген Т7 РНК полимеразы в этих системах клонируется под контролем имеющего достаточно высокий базовый уровень экспрессии промотора lacUV5, индуцируемого IPTG.

Другим широко используемым регулируемым промотором является araP_BAD , промотор арабинозного оперона Е. coli, коммерциализованный фирмой Intirogen. Этот промотор обладает широким диапазоном регуляции, однако он является менее эффективным, чем, например, tac промотор (Guzman et al., 1995). Кроме того, недостатком этой системы является гетерогенность клеточной популяции в условиях неполной индукции промотора, когда в некоторых клетках наблюдается полная индукция, в то время как в других - ее отсутствие (Siegele and Hu, 1997).

Наряду с бактериальными промоторами для регулируемой экспрессии используются также узнаваемые РНК-полимеразой клетки-хозяина промоторы фагов, в частности P_L промотор фага лямбда. Репрессия этого промотора достигается за счет экспрессии температурочувствительного мутанта лямбда-репрессора CI857, индукция происходит при повышении температуры с 30°С до 42°С (Elvin et al., 1990). Основным недостатком этой системы экспрессии также является высокий базовый уровень экспрессии, обусловленный как неполной репрессией мутантным CI белком, так и тем, что P _L промотор является холодоиндуцибельным (Giladi et al., 1995).

16.Экспрессия белков с использованием с регулируемыми элементами фага лямбда.Регулируемые промоторы

В качестве примера рассмотрим две системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют систему регуляторных элементов лактозного оперона , в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага лямбда .Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в обоих случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуляторные последовательности фага лямбда или lac-оперона , за которыми следуют последовательности нуклеотидов полилинкера с несколькими уникальными сайтами рестрикции, по которым проводится клонирование исследуемого гена. Одновременно в тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия молекулы репрессора, ген которого экспрессируется конститутивно, связываются с оператором, препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный рекомбинантный ген. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции клонированного гена, низкому внутриклеточному содержанию соответствующей мРНК и белкового продукта ее трансляции. ДНК профага может экспрессироваться в тех случаях, когда наблюдаются признаки стресса в клетке-хозяине. Стресс может быть вызван голоданием, ядами (например антибиотиком), или другим факторами, которые могут повредить или уничтожить хозяина. В этом случае профаг активируется, выделяет себя из ДНК клетки-хозяина и вводит ее в литический цикл. Активированный фаг уничтожает ДНК хозяина и производит большое количество собственной мРНК, чтобы произвести множество единиц фага. Когда все ресурсы хозяина исчерпаны от построения новых фагов, клетка-хозяин разрушается, клеточная мембрана разрывается, и новые фаги выходят во внешнюю среду.

Некоторые λ-векторы содержат ген β-галактозидазы. При создании рекомбинантного λ-вектора вместе с несу- щественной областью удаляется и ген β-галактозидазы. При инфицировании бактериальных клеток, выращиваемых на среде с X-gal, нерекомбинантным λ-вектором, на их колониях будут формироваться голубые бляшки. При инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным λ-вектором – будут формироваться бесцветные бляшки. Так можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный λ-векторы.

16.2 Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к PHК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке (и исследователю) осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученногоlac (лактозного)-оперонаE, coli. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезными для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным промотора, встраивают случайные фрагменты ДНК (рис. 6.1), Если в результате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то делают вывод, что клонированный фрагмент содержит функциональный промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продукты, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который идентифицируется с помощью достаточно простого колориметрического теста.

17.Системы экспрессии на основе бакуловирусов. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых.

Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы. Одна представлена отдельными вирио-нами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило клетки средней кишки, и способны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сама структура — полиэдроном. Синтез полиэдрина начинается через 36—48 ч после инфекции и продолжается 4—5 сут, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации их защищает белковый матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл.

Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который интересует исследователя. Исходя из этого на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных.

Наиболее широко используется вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантнымAcMNPV, получают из гусеницSpodoptera frugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка.

Первый шаг в конструировании рекомбинантного бакуловируса AcMNPVсостоит в создании транспортного вектора. Транспортный вектор- это производная плазмидыE. coli, содержащая фрагмент ДНКAcMNPV(рис. 7.8), который включает: 1) промоторную область и расположенную перед ней последовательность ДНКAcMNPV, необходимую для гомологичной рекомбинации сAcMNPV; 2) сайт для клонирования; 3) сайт терминации-полиаденилирования гена полиэдрина и прилегающую к нему последовательность ДНКAcMNPV— вторую область, обеспечивающую гомологичную рекомбинацию сAcMNPV(рис. 7.8). Кодирующая последовательность гена полиэдрина из этого фрагмента удалена. Интересующий исследователя ген встраивают между промотором и сигналом терминации гена полиэдрина и вводят конструкцию в Е. соli.

Культуру клеток насекомого, трансфицированную ДНК AcMNPV, трансфицируют затем транспортным вектором, несущим клонированный ген. В некоторых дважды трансфицированных клетках происходит двойной кроссинговер, в результате которого клонированный ген вместе с промотором и сигналом терминации транскрипции гена полиэдрина встраивается в ДНКAcMNPV(рис. 7.9), замещая ген полиэдрина. Вирионы, не содержащие этого гена, образуют зоны клеточного лизиса, из которых можно выделить рекомбинантный бакуловирус.

Визуальная идентификация зон лизиса — утомительная и субъективная процедура. Вместо нее для обнаружения рекомбинантных бакуловирусов можно использовать ДНК-гибридизацию или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Кроме того, если под контроль промотора бакуловируса, активного с ранних и до поздних стадии литического цикла, поместить ген lacZ E. coli., кодирующийß-галактозидазу, и такую конструкцию включить во фрагмент ДНК, встраивающийся в геномAcMNPV, то в присутствии хромогенного субстратаß-галактозидазы зоны с рекомбинантными вирусами окрасятся в синий цвет.

18.Системы для экспрессии белков в клетках животных. Векторы экспрессии на основе вирусов животных.

вирус SV40, вирус папилломы, аденовирусы, вирус герпеса, ретровирусы

Векторы на основе вируса SV40

Особенности строения вируса SV40

-гены SV40 в значительной степени перекрываются

-представляют собой кольцевую ДНК длиной 5 243 пн

-область начала репликации (ori) перекрывается с промоторными последовательностями ранней и поздней транскрипции

-белок Т-антигена является единственно необходимым для эффективной репликации вируса в инфицированных клетках

-Внедрение вируса в хромосомную ДНК не является сайт-специфическим

-при получении рекДНК важно сохранить неповрежденным участок начала репликации

-вставки или делеции без потери жизнеспособности SV40 могут происходить ограниченно: большинство векторов на основеSV40 получено замещением участка ДНК области поздних генов вируса по сайтамHpaII,EcoRI,BamHI,HaeII,AccI,KpnI

-Впервые экспрессия эукариотического гена β-глобина кролика была достигнута в лаборатории П. Берга в 1979 г

19. Электрофоретический анализ белков. Иммуноблоттинг и иммунодетекция. Аффинная хроматография белков.

19.1 Электрофоре́з белко́в — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки, основанный на движении заряженных белковых макромолекул различного молекулярного веса в стационарном электрическом поле. Электрофорезбелков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков является электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.

Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии и молекулярной биологии) в различных областях^[3]:

• Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)

  • Электрофорез с подвижной границей

  • Зональный электрофорез без поддерживающей среды

• Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой

  • Электрофроез белков в крахмальном геле^[4]

  • Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)^[5]

  • Электрофорез белков в агарозном геле

  • Электрофорез на фильтровальной бумаге

  • Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране

  • Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды

• Капиллярный электрофорез

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D) электрофорез^[6], препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков^[en] и электрофорез в присутствии детергента (в денатурирующих условиях). Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусированиеи изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.

В зависимости от конструкции электрофоретического аппарата различают горизонтальный и вертикальный электрофорез белков.

19.2 В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с после­дующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесен­ную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предвари­тельного фракционирования методами электро­фокусирования, диск-электрофореза или дву­мерного электрофореза — Вестерн-блот ана­лиз (Western blotting). Такая методология при­меняется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продук­ты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пас­сивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факто­ров, таких как молекулярная масса белков, по­ристость геля, время переноса и состав исполь­зуемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты.

В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуорид- ные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны.

Нитроцеллюлоза может связывать до 80- 100 мкг белка на 1 см2. Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок

после электропереноса, что снижает чувстви­тельность, однако использование глутарового альдегида для фиксации белков или нитроцел­люлозы с мелкими порами (0,2 мкм) значитель­но снижает эти потери. Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе доде- цилсульфата натрия (SDS), могут слабо перено­ситься на мембрану, если в транс-буфере при­сутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задерж­ке крупных белков. Мембрана ПВДФ оптими­зирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшие­ся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания. Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее мно­гократного использования. Нейлоновые мембра­ны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-бел- ки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низко­молекулярные белки также удерживаются эф­фективно. Благодаря высокой связывающей ем­кости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембра­ны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следо­вые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммо­билизованным на мембране, оставшиеся цент­ры связывания блокируют растворами желати­на, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока. Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти­

гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phos­phatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Sta­phylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-об- ласти иммуноглобулинов. Детекцию образован­ных иммунных комплексов проводят химиче­ским или хемилюминесцентным способом.

Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфа­тазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при ис­

пользовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода. В резуль­тате ферментативных реакций на мембране об­разуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело. Чув­ствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP.

Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью во­дорода и циклическим диацилгидразинлюми- нолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.

19.3 Аффинная хроматография — разновидность лигандной хроматографии. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормон-рецептор и т. д. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение.

20. Введение ДНК в клетки животных, растений, бактерий, дрожжей.

Необходимый этап генно-инженерного экс­перимента — введение полученных in vitro гиб­ридных молекул ДНК в пермиссивные клетки (обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов гибридов.

Введение в клетку нуклеиновой кислоты ви­руса с последующим образованием вирусного потомства называется трансфекцией. Эффек­тивность трансфекции выражается обычно ко­личеством инфекционных центров (бляшек, не­гативных колоний), приходящихся на молекулу или на единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полученные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами. Следует отметить, что нук­леиновые кислоты некоторых типов вирусов не- инфекционны, т. е. неактивны в тесте трансфек­ции. Это обусловлено тем, что для инициации экспрессии генома данных вирусов необходи­мы определенные вирусспецифические белки, содержащиеся в вирусных частицах, но отсут­ствующие в препарате очищенной нуклеиновой кислоты.

Процесс, в результате которого экзогенная ДНК проникает в реципиентную клетку и вы­зывает у нее наследуемые изменения, называют трансформацией. Трансформацию клеток мо­гут осуществлять как молекулы ДНК, реплици­рующиеся в клетках внехромосомно (плазми­

ды), так и молекулы ДНК, интегрирующиеся в геном клетки (линейные и кольцевые моле­кулы ДНК). Генетически трансформированные клетки принято называть трансформантами. Эффективность трансформации обычно выра­жают количеством клонов (колоний, образован­ных в результате делений исходно единичной клетки) трансформантов, приходящихся на мо­лекулу или единицу массы донорной ДНК. Дан­ную генетическую (биохимическую) трансфор­мацию необходимо отличать от онкогенной трансформации эукариотических клеток.

Физиологическое состояние клетки, в кото­ром она способна поглощать нуклеиновую кис­лоту из окружающей среды, называется компе­тентностью. Однако многие бактерии, а так­же дрожжи и культивируемые клетки животных и растений такой физиологической компетент­ностью не обладают. Поэтому восприимчивость к экзогенной ДНК у них индуцируют различны­ми способами. Такую компетентность принято называть индуцированной. Наиболее просто она достигается путем определенного химиче­ского или физического воздействия на клетки. Разные типы клеток имеют свои особенности строения клеточных стенок и плазматических мембран, поэтому они могут различаться по способам индукции у них компетентного со­стояния.

Исторически первым подходом к получению компетентных для трансфекции (трансформа­ции) клеток бактерий является ферментатив­ный гидролиз клеточных стенок, приводящий к удалению физического барьера на пути про­никновения молекул ДНК в клетку. Для этой цели можно использовать различные индиви­дуальные ферменты (например лизоцим) или смеси ферментов (например пищеварительный сок виноградной улитки). При ферментативной обработке клетки необходимо помещать в изо­тонический раствор (0,2 М сахароза; 1 М сор­бит; 0,6 М КС1 и др.), имеющий примерно такое же осмотическое давление, какое характерно для цитоплазмы клетки. В этих условиях клет­ки, лишенные своего жесткого «панциря» (кле­точной стенки), приобретают шарообразную форму и не лопаются от осмотического шока, наблюдаемого в гипотонической среде.

В 1982 г. Т. Вонг и Е. Нейман с сотрудника­ми для введения молекул ДНК в культивируе­мые клетки мыши применили метод, получив­ший название электропорация. В последую­щие годы метод был усовершенствован, что по­зволило использовать его эффективно как для

эукариотических, так и для прокариотических клеток. Суть данного подхода состоит в том, что кратковременное воздействие (обычно 5-20 мс) электрического поля высокой напря­женности (1-15 кВ/см) на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор (электропро­бой). Время существования и размер пор доста­точны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в ре­зультате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой систе­мы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы добиться высокой частоты поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оп­тимальных условиях электропорации количест­во трансформантов может достигать 80 % вы­живших клеток.

Электропорация — физический, а не хими­ческий метод, и это, по-видимому, обусловли­вает его широкое применение. Электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простей­шие, дрожжи, бактерии и протопласты расте­ний.

Электропорирующий эффект высоковольт­ного разряда на бислойную липидную мембра­ну, по-видимому, зависит от радиуса ее кривиз­ны. Поэтому для эффективного поглощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется значительно большая напряженность электри­ческого поля (10 кВ/см и более), чем крупным животным и растительным клеткам (1-2 кВ/см).

Электропорация — наиболее простой, эф­фективный и воспроизводимый метод введе­ния молекул ДНК в клетки. Однако до недавне­го времени он использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием се­рийных приборов — электропораторов. Появ­ление и совершенствование таких приборов привело к широкому применению данного ме­тода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

Разработка простых, эффективных и воспро­изводимых методов введения экзогенных моле­кул ДНК в нативной форме в пермиссивные клетки является необходимым условием успеш­ного развития работ по клонированию чужерод­ной генетической информации в клетках любо­го типа. Поэтому данному направлению иссле­дований уделяется пристальное внимание и оно постоянно развивается.

21. Выделение и очистка плазмидной ДНК в миниколличествах.

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

Амплификация в богатой среде

Амплификацию плазмид производят при выращивании бактерии-хозяина в богатой среде в присутствии хлорамфеникола. Ночную культуру (10 мл LB c добавлением антибиотика) пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в 25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют пока культура не достигнет поздней логарифмической фазы (D600=0,6). Переносят культуру в свежую среду LB с антибиотиком (500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титр удваивается), добавляют антибиотик до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 12-16 ч.

Лизис клеток

Разрушения бактерий для последующего выделения биологически активной ДНК можно добиться разными способами.

- Механические. При этом происходят многочисленные разрывы ДНК.

- У многих бактерий наступает лизис после добавления анионного детергента додецилсульфата (или лаурилсульфата). В частности, так можно разрушить бактерии кишечной группы, пневмококки и гемофильные бактерии. Додецилсульфат не только разрушает клетки, но и денатурирует некоторые белки. Однако затем он должен быть полностью удален из лизата (что и достигается при последующих обработках), так как его примесь в трансформирующей ДНК мешает самому процессу трансформации.

Некоторые грамположительные бактерии нельзя разрушить только додецилсульфатом или другими поверхностно-активными веществами. Вначале нужно удалить клеточную стенку и затем применить тот или иной детергент. Для разрушения клеточной стенки чаще всего применяют лизоцим. При концентрациях, которые чаще всего применяются для разрушения бактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функции лизоцима сводятся к разрушению клеточной стенки, в результате чего образуются хрупкие протопласты, легко разрушаемые детергентами. При больших концентрациях лизоцим может, видимо, влиять на связь ДНК с цитоплазматической мембраной и даже связываться с ДНК, осаждая ее. Кроме лизоцима, для той же цели употребляют проназу. Проназа способствует более полному гидролизу белка и поэтому лучшей последующей депротеинизации ДНК.

При разрушении бактерий в лизате в числе прочих ферментов появляются дезоксирибонуклеазы. Они, если действие их чем-либо не блокировано, могут тут же разрушить ДНК. Обычно от них защищаются, добавляя вещества, которые связывают ионы магния, требующиеся для работы большинства ДНКаз. Вещества, связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат), которые добавляют при лизисе клеток для инактивации дезоксирибонуклеаз и предохранения выделяющейся ДНК, подавляют поглощение ДНК компетентными клетками. Додецилсульфат и дезоксихолат также подавляют трансформацию. Лизоцим и проназа, остающиеся в лизате, сами могут лизировать компетентные клетки. В ряде случаев от нежелательных примесей, мешающих трансформации, можно избавиться за счет его разведения.

Для депротеинизации лизата при выделении ДНК используют обработку фенолом, который осаждает додецилсульфат и инактивирует все белки, в том числе и дезоксирибонуклеазы.

Очистка ДНК

В этих методах очистки так или иначе используют два основных различия между хромосомальной ДНК бактерий и плазмидной ДНК:

1) хромосомы бактерий по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов;

2) основная масса ДНК бактерий выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК бактерий, случайно захваченные обломки лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК бактерий остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК бактерий также и при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистыйэтидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и поэтому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантной ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующими эндонуклеазами, лигирование, трансформацию и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее препараты (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5`-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

22. Методика трансформации клеток E. coli плазмидной ДНК. Трансформация E. coli посредством плазмидной и бактериальной ДНК отличается некоторыми особенностями адсорбции и поглощения ДНК по сравнению с  трансформацией у других бактерий и осуществима только в лабораторных условиях. Видимо, трансформирующая ДНК при этом на начальных стадиях претерпевает гораздо меньшие изменения, чем у тех бактерий, для которых трансформация является естественным процессом; она почти не фрагментируется и не образует однонитевых молекул. Однако внутри клетки поступившая в нее линейная ДНК в значительной мере разрушается АТФ-зависимой ДНКазой. Этим, видимо, объясняется то обстоятельство, что трансформация посредством хромосомной ДНК успешно проходит лишь в клетках, лишенных этого фермента (recBC sbcB). Кроме того, в таких клетках отсутствует и  активность экзонуклеазы I. Такое сочетание мутаций возвращает клетке способность к  рекомбинации. Считается, что рекомбинация при этом идет за счет иных механизмов, чем в клетках исходного генотипа, - по так называемому пути recF. Используют также другой класс мутантов – recBC sbcA. У них также отсутствует активность АТФ- зависимой ДНКазы, но появляется активность другой экзонуклеазы – так называемой экзонуклеазы VIII. Конкретные молекулярные механизмы рекомбинации здесь опять- таки не выяснены; путь, по которому у мутанта recBC sbcA идет рекомбинация, называется путем recE. В качестве реципиентных клеток в большинстве случаев используют штаммы С600hsdR-hsdM- и HB101hsdR-endA-recA-. Мутация hsdR, блокируя клеточную систему рестрикции, предохраняет тем самым клонируемые фрагменты от действия рестриктазы EcoK. Мутации endA- и  RecA- предотвращают расщепление трансформирующей ДНК клеточными нуклеазами. После проникновения ДНК (инфекционной фаговой или плазмидной) в клетку нет последующего включения этой ДНК в хромосому. Как суперскрученная, так и  релаксированная плазмидная ДНК трансформировала клетки с примерно одинаковой эффективностью. ДНК более крупных плазмид обладала худшей способностью к трансформации, чем ДНК мелких плазмид. Одновременное добавление к клеткам любой другой ДНК снижало выход трансформантов независимо от происхождения конкурирующей ДНК и ее размеров. Если для трансформации брали мономерную линейную ДНК плазмиды рВR322, предварительно превращенную в линейную, то количество трансформантов по сравнению с суперскрученной формой в клетках штамма с ненарушенной способностью к рекомбинации падало в 100-1000 раз. Если в качестве реципиентов были взяты мутанты recA, recBC и recF, то количество трансформантов посредством суперскрученной ДНК оставалось без изменения, а эффективность трансформации посредством линейной ДНК уменьшалось еще больше, чем в клетках исходного генотипа (дополнительно в 10-40 раз). Вероятно, в клетки кишечной группы бактерий, ставшие компетентными после обработки хлористым кальцием, может проникать кольцевая плазмидная ДНК, не претерпевая разрывов (в отличие от грамположительных микроорганизмов). Если же ДНК искуственно превращали в  линейную, то она с достаточной низкой частотой рециркуляризовалась в клетке (как у бацилл, пневмококков и стрептококков). При этом превращение линейной формы в  кольцевую происходило за счет внутримолекулярной рекомбинации между прямыми повторами. Этот процесс нуждался в рекомбинационных системах клетки (в частности, в наличии АТФ-зависимой ДНК-азы, образование которой у кишечной палочки детерминируется генами recВС) и был облегчен у димерных форм плазмид. Применение так называемых tonB-мутантов, у которых изменена структура клеточной стенки, в дополнение к мутациям recBC sbcAB позволяет повысить частоту образования трансформантов. Культура кишечной палочки обладает различнойспособностью к  трансформации после обработки хлористым кальцием в разные периоды роста. В самом начале и конце роста культуры трансформантов почти не возникает. Наибольшее их число образуется, если берут клетки в середине-начале логарифмической фазы роста. Интересно, что именно на этот период падает максимальное снижение числа жизнеспособных клеток после соответствующих обработок. Тогда же наблюдается наибольшее «истечение» ферментов, расположенных в периплазматическом пространстве из клеток во внешнюю среду. Таким образом, у E. coli имеется стадия роста, в которую может быть сообщена компетентность при трансформации, и в этот период клетки наиболее «хрупки». Оптимальное значение рН для трансформации при кальциевой методике равно 7-8. Насыщающие концентрации ДНК при трансформации кишечной палочки несколько выше, чем у большинства микроорганизмов – около 10 мкг/мл. Зависимость количества трансформантов от концентрации ДНК при ненасыщающих концентрациях близка к линейной. Судя по частоте появления трансформантов, число компетентных клеток в культуре при кальциевой методике составляют лишь незначительную часть популяции. В отличие от других бактериальных видов у кишечной палочки оптимальная величина фрагментов трансформирующей ДНК ограничена не только нижними, но и  верхними пределами. Больше всего трансформантов образуется, если использовать ДНК с молекулярным весом 10-30 мегадальтон. Имеются косвенные данные, свидетельствующие о том, что трансформирующая ДНК кишечной палочки проникает в клетку в двунитевом состоянии и в дальнейшем не образует однонитевых структур. Трансформация посредством плазмидной ДНК может осуществляться и с  помощью метода замораживания-оттаивания клеток. Эффективность трансформации была не ниже, чем при употреблении кальциевого метода. Методика сводится к  непродолжительному замораживанию бактериальных клеток совместно с ДНК при – 70оС и последующему оттаиванию при 37оС. Поглощение ДНК происходит очень быстро. В момент оттаивания, менее, чем за минуту; обработка ДНКазой оттаявшей суспензии уже не препятствует трансформации. Судя по быстроте поглощения ДНК здесь происходит поглощение ДНК не протопластоподобными структурами, а  интактными клетками. При кальциевой методике применяется комбинация таких воздействий как выдерживание клеток на холоду и их обработка хлористым кальцием. Хлористый кальций может быть заменен хлористым барием и хлористым рубидием. Инкубация при 37оС обязательна для генетической трансформации. Ионы кальция действуют лишь при 37оС, т.е. на заключительных этапах обработки клеток. Механизмы проникновения ДНК сильно различаются в зависимости от применения той или иной из методик и мало изучены. В случае возникновения компетентности при замораживании-оттаивании клеток E. coli ДНК поглощают не протопласты, а интактные клетки, у которых из-за соответствующей обработки резко меняется проницаемсть для макромолекул. Сам молекулярный механизм такого поглощения неизвестен. Существуют различные гипотезы о роли хлористого кальция при применении кальциевого способа получения компетентных клеток E. coli. Ионам кальция приписывалась определенная роль в нейтрализации отрицательных зарядов клеточной поверхности, что может способствовать адсорбции также отрицательно заряженных макромолекул ДНК. Предполагали, что хлористый кальций может денатурировать какие-то белки на поверхности клетки, что также способствует адсорбции и  проникновению ДНК в клетку, или действовать на липиды клеточной стенки. Имеются предположения об активации им ферментов-фосфолипаз, влияющих на проницаемость, или гипотетических у E. coli ферментов, участвующих в активном транспорте ДНК. Во всяком случае, эта обработка сокращает число жизнеспособных клеток, возможно, повреждая их клеточные стенки; имеется обратная зависимость между выживаемостью клеток и частотой генетической трансформации после кальциевой обработки. Главный этап в молекулярном клонировании - введение рекомбинантной ДНК в  бактериальные клетки. В основе большинства методов бактериальной трансформации лежит наблюдение, согласно которому обработка бактерий хлористым кальцием увеличивает эффективность поглощения ими молекул ДНК. Выход трансформантов в  большинстве случаев составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК бактерии. Модификациями основного метода пытались увеличить эффективность трансформации у разных штаммов бактерий. Можно подобрать условия, в которых штаммы бактерий воспроизводимо дают 107-108 трансформантов на 1 мкг интактной ДНК. Следует учитывать, что компетентна, т.е. способна поглощать плазмидную ДНК, только небольшая фракция клеток (в трансформации участвует лишь 1 из 10000 молекул ДНК). После проникновения в бактерию происходит репликация плазмидной ДНК и  начинается экспрессия маркеров устойчивости к лекарственным препаратам, в  результате чего трансформанты приобретают устойчивость к антибиотику. Бактерии способны поглощать ДНК в течение короткого периода времени, но в  результате выдерживания с агентами, повышающими эффективность трансформации, большинство бактериальных штаммов приобретает способность сохранять состояние компетентности на протяжении 1-2 дней. Компетентные клетки можно приготовить в  больших количествах, проверить и хранить замороженными. Главный этап в молекулярном клонировании - введение рекомбинантной ДНК в  бактериальные клетки. В основе большинства методов бактериальной трансформации лежит наблюдение, согласно которому обработка бактерий хлористым кальцием увеличивает эффективность поглощения ими молекул ДНК. Выход трансформантов в большинстве случаев составляет 105-107 на 1 мкг интактной ДНК бактерии. Модификациями основного метода пытались увеличить эффективность трансформации у разных штаммов бактерий. Можно подобрать условия, в которых штаммы бактерий воспроизводимо дают 107-108 трансформантов на 1 мкг интактной ДНК. Следует учитывать, что компетентна, т.е. способна поглощать плазмидную ДНК, только небольшая фракция клеток (в трансформации участвует лишь 1 из 10000 молекул ДНК). После проникновения в бактерию происходит репликация плазмидной ДНК и  начинается экспрессия маркеров устойчивости к лекарственным препаратам, в  результате чего трансформанты приобретают устойчивость к антибиотику. Бактерии способны поглощать ДНК в течение короткого периода времени, но в  результате выдерживания с агентами, повышающими эффективность трансформации, большинство бактериальных штаммов приобретает способность сохранять состояние компетентности на протяжении 1-2 дней. Компетентные клетки можно приготовить в  больших количествах, проверить и хранить замороженными.

23. Методика постановки ПЦР.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp^[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований^[9].