IgnatovSG

21

как ожидается, будет более стабильной по сравнению с ферментами, полученными путем выделения и очистки. Для создания потенциально новых систем биологического узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов исследовали три типа бактерий со специфически индуцированными ферментативными системами. Для индукции лактатоксидазной системы культивировали штаммы E. coli и M. luteus в среде, где в качестве источника углерода использовали соли лактата. Клетки A. aceti выращивли в анаэробных условиях для индукции этанолоксидазной системы.

На примере метода криоиммобилизации были отработаны методы иммобилизации бактериальных клеток и их фрагментов. Сущность метода состоит в замораживании микробных клеток в растворе поливинилового спирта, в ходе которого происходит формирование макро- и микроструктуры матрицы криогеля, при этом поликристаллы замороженного растворителя выступают в роли порообразователей. Получаемые гранулы (пленки) обладают, наряду с высокой пластичностью, достаточно высокой механической прочностью. Матрица криогеля, будучи высокопористой структурой, не создает диффузионных затруднений для основной массы соединений.

Установлено, что удельная респираторная активность иммобилизованных клеток и мембран бактерий была постоянной во всех образцах и не зависела от величины навески, а количество потребляемого кислорода в реакционной ячейке зависело от количества иммобилизованного биокатализатора.

2.4 Биосенсоры на основе ЦПМ

Цитоплазматические мембраны (ЦПМ) бактерий представляют собой липидный бислой с инкорпорированными белками. Бактериальные ЦПМ играют важную роль в многочисленных биологических процессах, таких как дыхание и перенос энергии. Способность индукции определенных ферментативных систем в ЦПМ в ходе культивирования бактерий делает мембраны весьма привлекательным инструментом при конструировании биосенсора путем выделения таких мембраносвязанных ферментативных комплексов с

22

последующей иммобилизацией их на твердой подложке с сохранением нативности и биологической активности.

Была изучена возможность модификации поверхностного заряда ЦПМ бактерий для дальнейшего изучения его влияния на чувствительность и стабильность биосенсорного узнающего элемента. Для этого мы использовали модификаторы поверхностного заряда: цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (положительно заряженный) и додецилсульфат натрия (SDS) (отрицательно заряженный). Первоначально было показано, что добавление ЦТАБ в диапазоне концентраций 10–50 мкМ увеличивает потребление кислорода ЦПМ бактерий в присутствии НАДН, отрицательно заряженного субстрата дыхания. Добавление же SDS в диапазоне концентрации 10–50 мкМ в этих же условиях, наоборот, уменьшало потребление кислорода мембранами. Повидимому, данное изменение потребления кислорода ЦПМ и связано с электростатическим взаимодействием заряженного субстрата с заряженной поверхностью бактериальных мембран. Для доказательства наличия зарядовой модификации поверхности мембран мы решили оценить изменения поверхностного заряда с помощью положительно заряженного флуоресцентного зонда disC и отрицательно заряженного флуоресцентного зонда ANS. В качестве модификаторов поверхностного заряда мы использовали ЦТАБ и SDS. Добавление к мембранам положительно заряженного модификатора ЦТАБ увеличивало интенсивность флуоресценции отрицательно заряженного зонда ANS. В свою очередь, добавление отрицательно заряженного модификатора SDS уменьшало интенсивность данного флуоресцентного зонда.

Таким образом, была установлена возможность модификации поверхностного заряда бактериальных ЦПМ с помощью положительно заряженного модификатора ЦТАБ и отрицательно заряженного модификатора SDS. Дальнейшие исследования показали, что поверхностный заряд является барьером проницаемости мембранного аппарата для заряженных субстратов и должен учитываться при конструировании биологической системы узнавания биосенсора.

23

2.5 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ

Лактат является важным метаболитом при анализе пищи, поэтому для его определения создано большое количество биосенсорных измерителей. Данные подходы анализа лактата требуют присутствия НАДН или ДЕАЕдекстран:лактинола, а также присутствия термостабильной пероксидазы из сои. Нестабильность таких комплексов и необходимость присутствия коэнзимов существенно ограничивают их практическое применение.

Рисунок 8 - Схема волоконно-оптического биосенсора для определения лактата

В нашей работе описана конструкция волоконно-оптического биосенсора, основанного на новом типе биологического узнающего элемента - бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). В качестве вторичного преобразователя использовали волоконно-оптический сенсор для определения кислорода, а в качестве биологического узнающего элемента – ЦПМ. В результате такой комбинации был сконструирован новый тип биосенсора для определения лактата (рис. 8). Его специфичность оценивали по влиянию таких биологически важных соединений как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота на сигнал прибора.

На рис. 9 видно, что присутствие данных субстратов в концентрации 50 мМ не влияет на определение лактата. Нами было обнаружено, что ковалентное связывание чувствительного к кислороду слоя красителя на поверх-

24

Рисунок 9 - Специфичность лактатного биосенсора к другим субстратам

ность оптического волокна улучшает механическую стабильность сенсора. Другие инструментальные приспособления при конструировании данного сенсора не оказывали значительного влияния на его ответ. Таким образом, была показана способность конструирования биосенсора на основе ЦПМ бактерий. Полученный биосенсор специфически реагирует с лактатом и нечувствителен к наличию в среде измерения таких субстратов как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота. Уникальная организация ЦПМ совместно с высокой чувствительностью волоконно-оптической системы позволяет применять данные сенсоры как для анализа активных субстратов, так и для косвенного определения бактериальных клеток.

Для определения лактата в молоке был разработан биосенсор на основе бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). Нативная организация ферментативных комплексов в липидных бислоях ЦПМ обеспечивала стабильность и высокую чувствительность узнающего элемента биосенсора.

Для подсчета бактериальных клеток в свежем молоке коровы его образцы высевали на плотные питательные среды и подсчитывали колонии после 18 час инкубации. С помощью биосенсора удалось установить корреляцию между концентрацией лактата в молоке и его бактериальной обсемененно-

25

стью. Концентрация лактата в молоке, равная 5 мМ, соответствует 0,3х106 клеток/мл. После 3 ч инкубации при 37 °С концентрация лактата составляла 10 мМ, а бактерий - 106 клеток/мл; после 6 час инкубации – 20 мМ лактата и 107 клеток/мл. С помощью нашего биосенсора можно определить критическую точку, характеризующую качество молока, которая соответствует концентрации бактерий 106 клеток/мл или 10 мМ лактата.

2.6 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидантной активности

На рис. 10 представлена схема определения антиоксидантной активности различных субстратов.

нA

3 4 5 6

A

A’

A’’

1 2

1 мин

Рисунок 10 - Схема отклика сенсорного электрода на образование супероксида при добавлении антиокисиданта и супероксиддисмутазы. 1 – добавление 100 мM гипоксантина; 2 – добавление ксантиноксидазы, 50 мЕ/мл; 3,4,5 – добавление антиокисиданта; 6 – добавление супероксиддисмутазы, 2 Е/мл. А, А’ и А’’- понижение сигнала при различной концентрации антиокисиданта в среде

Как известно, антиоксиданты предохраняют организмы от вредного воздействия активных форм кислорода. Поэтому использование биосенсорного подхода для регистрации антиокидантных свойств веществ нашло важное

26

применение в медицине и пищевой промышленности. Для определения антиоксидантной активности различных веществ показана высокая эффективность использования супероксидно-специфического амперометрического биосенсора (рис. 10).

Антиоксидантная активность субстратов представлена в табл. 2.

Таблица 2 - Антиоксидантная активность субстратов, где I50 As.ac – концентрация аскорбиновой кислоты, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, I 50 – концентрация субстрата, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, E asc,ac – Единицы аскорбиновой кислоты (I 50

As.ac/ I 50)

Вещество	Сигнал	I 50 As.ac,	I 50,	E asc,ac
	электрода, нА	мкМ	нМ
(-) Эпигаллокатехин	0,8	9,0	83,7	107,5
(+) Катехин	0,4	9,6	600,0	16,0
(+/-) Катехин	0,8	9,0	277,0	32,4
Пирогаллол	0,8	9,0	262,7	34,3
Мирицетин	0,6	7,7	454,7	17,0
Кверцетин	0,7	4,8	2400,0	2,0
Танниновые кислоты	0,8	6,6	473,0	14,0

Исследование данных веществ показало их высокую антиоксидантную активность. Установлено, что обработка бактериальных клеток данными антиоксидантами частично предотвращает их элиминацию в мышиных макрофагах.

Глава 3 Бионанотехнологические подходы исследования в микробиологии

3.1 АСМ микроскопия вирусов

Вирусы были выбраны для исследования как наименьшие живые биологические структуры. Существует два метода иммобилизации вирусов: специфическая и неспецифическая. Неспецифический метод заключается в нанесении капли вирусной суспензии на поверхность. Специфический метод основан на предварительной модификации поверхности специфическими антителами. Стандартные методы получения монослоев вирусных антител базируются на ковалентном связывании антител с поверхностью. Хорошо известно, что монослои антител и ферментов могут терять свою активность.

27

Чтобы этого не происходило, используют амфифильные полиэлектролиты и липиды. Был разработан метод с использованием лэнгмюровских пленок антител на амфифильном полиэлектролите для иммобилизации ротавирусов и аденовирусов с последующей визуализацией методом АСМ. Аденовирусы и ротавирусы – важные патогены человека. На рис. 11 представлены АСМ изображения аденовирусов и ротавирусов, полученные с помощью неспецифи-

ческой иммобилизации.
А	Б

Рисунок 11 - АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на поверхности. Справа показан вертикальный профиль поверхности

Такие образцы очень нестабильны и быстро разрушаются при хранении. Чтобы повысить специфичность и стабильность иммобилизованных вирусов, использовали антитела для их специфического связывания с поверхностью. Для этого применяли лэнгмюровские пленки антител на амфифильных электролитах – полиэтиленимине и полибензилгистидине. Применение таких электролитов делает возможным предохранение конформации белковой глобулы от действия инактивирующих факторов на границе раздела фаз воздух/вода и приводит к усилению взаимодействий между компонентами лэнгмюровских пленок. Были протестированы различные условия образования монослоев полиэлектролитов. В качестве критерия использовали степень шероховатости получаемых пленок. В случае полибензилгистидина стало возможным получать пленки толщиной 1,5-2 нм и шероховатостью 0,2 нм, что в результате приводит к увеличению аффинности пленок полимер/антитело.

После месяца хранения при +5 °С пленки антител оставались целыми, сохраняя свою иммунную активность. Для определения толщины получен-

28

ной пленки антител специально разрушали небольшую область ее поверхности. Разница в высоте разрушенного и целого слоев интерпретировалась как толщина пленки, которая составляла 8-12 нм в зависимости от выбранной области и материала субстрата (рис. 12).

Рисунок 12 - Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки. Слева (А) показан участок пленки, специально разрушенный для оценки толщины пленки. Справа (В) показана нативная пленка

Используя этот подход, можно получать специфически иммобилизованные аденовирусы и ротавирусы. На рис. 13 представлены АСМ изображения ротавирусов и трехмерное изображение аденовирусов.

А

Б

Рисунок 13 - АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение аденовирусов (Б), специфически связанных с пленкой соответствующих антител, образованной на амфифильном полимере

3.2 АСМ микроскопия бактерий

Существует множество методов исследования бактерий. Качественную и количественную характеристики бактериальных клеток можно получить методами световой и электронной микроскопии, фотоэлектронной микроскопии Х-лучей, ИК-спектроскопии, измерениями контактного угла и электрофоретической мобильности. Однако многие из этих методов требуют спе-

29

циальной подготовки и условий вакуума во время анализа и не могут быть использованы для нативных исследований. В последние годы в микробиологии открыт новый способ исследования бактерий. АСМ микроскопия обеспечивает получение 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях. Поверхность живых бактериальных клеток - это очень сложная гетерогенная структура, содержащая липидные, белковые и углеводные компоненты. Организация некоторых мембранных областей играет важную роль во взаимодействии клеток с поверхностью и между собой. Вместе с тем, несмотря на то, что ультраструктура микробной поверхности изучается методом электронной микроскопии уже более 30 лет, прямой информации о ее строении в нативном состоянии получить таким способом нельзя. Понимание процессов адгезии и агрегации бактериальных клеток требует не только знания физико-химических свойств (гидрофобности и электрических свойств) и химического состава, но также наномеханических свойств и ультраструктуры их поверхности. Уникальная возможность АСМ представлять бактериальный мир в субнанометровом диапазоне и в водном растворе может быть использована для исследования как самих клеток, так и их поверхности в физиологических условиях. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. В водных средах микроорганизмы имеют тенденцию образовывать колонии на твердых поверхностях, создавая биопленки. Это вызывает загрязнение трубопроводов, морских сооружений и кораблей. Протекающие при этом коррозиционные процессы также изучаются методами АСМ.

30

В данной работе мы использовали АСМ для идентификации патогенных бактериальных клеток. Некоторые АСМ изображения получены с использованием неспецифической адсорбции бактерий (рис. 14).

Рисунок 14 - АСМ изображение клеток M. tuberculosis

Для специфической визуализации бактерий был разработан новый подход, основанный на иммобилизации специфических антител непосредственно на твердой подложке через связывание антител стафилококковым белком А. Белок А специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител. Получены изображение слоя белка А (рис. 15) и 3D изображения специфически иммобилизованных бактерий и спор (рис. 16) с использованием слоя белка А для чувствительной иммобилизации специфических антител.

Рисунок 15 - Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А

АСМ очень важна при быстрой и суперчувствительной детекции патогенов. Уникальные возможности АСМ можно использовать в дальнейших исследованиях в нанобиотехнологии не только для детекции бактериальных клеток и вирусов, но и для очень чувствительного определения нанофрагментов этих объектов.