IgnatovSG

41

чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиоксидантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не изучено. Поэтому разработка такого типа биосенсора является перспективным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии – современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализировать такие процессы, как реакция гемагглютинации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наночастиц.

ВЫВОДЫ

1.Показана принципиальная возможность применения электрооптического метода для анализа физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2.Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорга-

42

низмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антителами или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов по выделению или поглощению ими летучих компонентов, из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля продукции антибиотика. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5.Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цитоплазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсемененностью коровьего молока.

6.Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анализа антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением действия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7.Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нанофрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

43

8.Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использованы уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображения ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

9.Для поверхностей с многофункциональными биоактивными наноструктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоединений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Нефелова М.В., Игнатов С.Г., Чигалейчик А.Г., Виноградов Б.Д., Егоров Н.С. Биосинтез L-аспарагиназы II Bacillus polimixa var Ros. // Прикл. био-

хим. и микробиол. - 1978. - Т. 14. - № 4. - С. 510-515.

2.Решетняк В.И., Игнатов С.Г., Вострокнутова Г.Н. Влияние естественной и искусственной модификации мембран на энергетику бактериальной клетки. // Энергетика и углеводный обмен у микроорганизмов. Рига. - 1979. - С. 64-65.

3.Игнатов С.Г., Александрова Л.А., Евдокимова О.А., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С. Роль липидов в процессе репарации и восстановлении мембранных функций после низкотемпературного замораживания E.coli.// Липиды биологических мембран. Ташкент. - 1980. - С. 59.

4.Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокисова О.А., Арцатбанов В.Ю., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Роль липидов в процессе репарации и восстановления мембранных функций после низкотемпературного замораживания.// Тезисы Научной Конференции молодых уче-

ных, Оболенск. - 1980. - С. 187-199.

5.Игнатов С.Г., Красильников В.А., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Изучение функциональных и структурных изменений мембран E.coli после низкотемпературного замораживания.// Биохимия. - 1981. - Т. 46. - №11. - С. 1996-2003.

6.Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокимова О.А., Арцатбанов В.Ю., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Изучение репарации мембранных повреждений, вызванных низкотемпературным замораживанием клеток E.coli.// Биохимия. - 1982. - Т. 47. - №10. - С. 1621-1628.

7.Игнатов С.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Методика электрооптического анализа сухих препаратов.// Методика Т-4061. - 1986. - мбВ 1/1725. - м. 15. - С. 130-138.

44

8.Игнатов С.Г., Драгунова С.Ф., Перелыгин В.В., Воробьев А.А. Роль комплемента в защите макроорганизма от бактерий.// Журнал микробиол.

эпидемиол. и иммунол. - 1987. - № 5. - С. 97-102.

9.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Измерение электрооптических свойств E.coli.// XI научная конференция по итогам НИР 1986, сек-

ция-8”, Оболенск. - 1987. - С. 15.

10.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Светогоров Д.Е., Щепкина А.Н. Использование электрооптического метода для оперативного определения жизнеспособности бактериальных кле-

ток.// Микробиол. - 1989. - Т. 58. - № 3. - С. 515-517.

11.Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Анализ возможности использования нелинейной области электрооптического эффекта для определения концентрации и анизотропии поляризуемости бактериальных клеток.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 15.

12.Светогоров Д.Е., Бунин В.Д., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н. Оперативная диагностика состояния бактериальных клеток в процессе производства препаратов по результатам ЭО исследований.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 19-20.

13.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Использование электрооптического метода и кратковременных экстремальных воздействий для оценки устойчивости бактериальных клеток к процессу высушивания.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 24.

14.Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Изменение электрооптических свойств E.coli в ходе сушки клеток.// Научная конференция по ито-

гам НИР 1989, Оболенск. - 1990. - С. 40.

15.Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.//

Коллоидный журнал. - 1991. - Т. 55. - С. 365-367.

16.Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. Биосенсор на лизин на основе pCO2 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. - № 5. -

С. 110-111.

17.Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. L-лизиновый биосенсор на основе pCO2 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. -

№ 6. - С. 63-64.

18.Ignatov S.G., Dragunova S.F. Surface charge controls the barrier properties of the E.coli cell envelope.// J. Biochem. Org. – 1994. - V.1. - Р. 363-373.

19.Игнатов С.Г. Новый метод определения комплемент-опосредованного бактериолитического действия сыворотки на клетки E.coli.// Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 1994. - № 6. - С. 99-100.

20.Игнатов С.Г., Бесаева С.Г., Кувичкин В.В. Изучение потребления глюкозы при культивировании S.avermitilis 1301 с использованием биосенсорного измерителя.// Биотехнология. - 1995. - Т. 32. - № 1/2. - С. 54-55.

45

21.Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Использование электрооптического метода для контроля бактериальных препаратов. Прикладная биохим. и микробиол. - 1996. - Т. 32. - № 6. - С. 669-670.

22.Ignatov S.G. Biosensors based on CPM In International Symposium “Development of medical equipment technology converted from weapon sciences”, Podolsk, Moscow Region. - 1996. - Р. 54.

23.Ignatov S.G. The role of diamines on bacterial survival after freezing. In “International symposium on stress and inorganic nitrogen assimilation & the 2nd FOHS biostress symposium”. Moscow. - 1996. - P. 34.

24.Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells. NATO ASI SERIES Workshop “Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment”. Warsaw. - 1997. - P. 33.

25.Ignatov S.G. Biosensor based on bacterial cytoplasmic membranes. ARW “New trends in biosensor development”. Kiev, Ukraine. - 1998. - P. 25.

26.Ignatov S.G. Bacterial cytoplasmic membranes as a native organized biocatalysis system in biosensorology.// Biocatalysis-98: fundamental and applications. Pushino. - 1998. - P. 18.

27.Ignatov S.G. New recognition element for biosensor based on cytoplasmic membranes.// 6th SAS-Deauville Conference-98. Valencia, Spain. - 1998. - 98P. - P. 375.

28.Ignatov S.G. Biosensors, biotechnology.// German-Russia ISTC workshop Biotechnology, DEHEMA-99. Wiesbaden, Germany. - 1999. - P. 25.

29.Ignatov S.G. Biosensor based on the bacterial cells for glucose monitoring in the blood.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

30.Ignatov S.G. Development of the rapid method for determination of comple- ment-mediated serum bactericidal activity against gram-negative bacteria.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

31.Ignatov S.G., Besaeva S.G. Avermitelis controlling in cultivation media by using glucose biosensor.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 101.

32.Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Гаврюшкин А.В. Современные тенденции в области определения возбудителей инфекционных болезней.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - C. 271.

33.Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Контроль глюкозы в среде культивирования Streptomyces avermititlis с помощью биосенсора.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - C. 228.

34.Makhlis T., Efremenko E., Varfolomeev S., Kaprelyants A.S., Ignatov S.G. Elaboration of stable biosensors based on the membranes of regular and dormant cells Micrococcus luteus, immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogen for the detection of NADH and lactate.// Biocatalysis-2000. Moscow. - 2000. - P. 121.

35.Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells.// In book “Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment” (Ed.P.J.Stopa, M.A.Bartoszcze), NATO ASI Series. - 2000. - V. 30. - P. 93-100.

46

36.Ignatov S.G., Ge B., Shishniashvili D., Scheller F.W., Lisdat F. The antioxidant activity detection of the flavonoids using superoxide sensor.// Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Pushchino. - 2000. - P. 95.

37.Ge B., Lisdat F., Shishniashvili D., Ignatov S.G., Scheller F.W. Detection of antioxidant activity using a superoxide sensor.// Biosensor-2000. San Diego USA. - 2000. - P. 251.

38.Ignatov S.G., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F. Detection of the antioxidant activity of flavonoids by using superoxide sensor.// In book “Nitric oxide: basic research and clinical application” (Ed.R.J.Gryglewski, P.Minuz) IOS Press, NATO Science Series, Science A: Life Science. - 2001. - V. 317. - P. 168-180.

39.Ignatov S.G., Ferguson J.A., Walt D.R. A fiber-optic lactate sensor based on bacterial cytoplasmic membranes.// Biosensors and Bioelectronics. - 2001. - V. 16. - № 1. - P. 109-113.

40.Stitzel S.E., Albert K.A., Ignatov S.G., Walt D.R. Artificial nose employing microsphere sensor for detection of volatile organic compounds.// Proc. SPIE. - 2002. - V. 4575. - P. 132-137.

41.Ignatov S., Shishniashvili D., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for the detection of antioxidants.// Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - V. 17. - № 3. - P. 191-199.

42.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Kozodaev M.A., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. AFM study of bacteriaphages.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2002. - P. 356357.

43.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Nanobiotechnology for microbiology.// MicroRobots, MicroMachines and MicroSystems. Moscow. - 2003. - P. 345.

44.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. AFM study for specific visualization of bacteria and spores.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2003. - P. 218-219.

45.Ignatov S. G. Atomic force microscopy for nano analysis of bacteria.// Canadian Biological Colloquium. Moscow. - 2004. - P. 79.

46.Ignatov S.G. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces.// The 5-th ISTC/Korea workshop on biotechnology. Korea. - 2004. - P. 67-102.

47.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces for sensitive bacteria detection.// The proceedings for the 37 ISTC Japan Workshop on Advances Nanomaterials in Russia/CIS. Tsukuba, Japan. - 2005. - P. 148-162.

48.Вирясов С.Н., Голутвин И.А., Насикан Н.С., Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е. Способ приготовления аффинных поверхностей на основе химически прошитого белка А.// Патент РФ 2005. RU 2261279 C1.

49. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Biketov S.F. Nano-approach for sensitive monitoring of bacteria.// NSTI Nanotech. Boston. USA. - 2006. - P. 57.

47

50.Волошин А.Г., Бесаева С.Г., Веревкин В.В., Игнатов С.Г. Адаптация электрооптического метода для изучения взаимодействия фаг-бактерия.// VII Межгосударственная научно-практическая конференция государствучастников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории госу- дарств-участников СНГ". Оболенск. - 2006. - C. 190-192.

51.Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Акимова Л.А., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Косарев Н.В., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е., Игнатов С.Г. АСМ визуализация взаимодействия латексных частиц, модифицированных антителами в присутствии антигена.// VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ".

Оболенск. - 2006. - C. 250-251.

52.Dubrovin E., Fedyukina G., Ignatov S., Ignatyuk T., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM.// 8th International EMBL PhD Student Symposium. Heidelberg, Germany. - 2006. - P. 46.

53.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E. Specific visualization of bacteria and spores by AFM.// IX Annual Linz Winter Workshop “Advances in Single-Molecule Research for Biology & Nanoscience”. Austria. - 2007. - P. 4-14.

54.Игнатов С.Г., Федюкина Г.Н., Мочалов В.В., Акимова Л.А., Баранова Е.В., Колосова Н.В., Рудницкий С.Ю. Визуализация аффинных взаимодействий методом атомно-силовой микроскопии.// Материалы XV международной конференции IT+ME. Гурзуф, Украина. - 2007. - С. 315-317.

55.Dubrovin E., Ignatov S., Ignatyuk T., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM. Biophysical Journal. - 2007. - Suppl. S. - Р. 514A-515A.

56.Краевский С, Волошин А., Дубровин В.Е., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Яминский И.В. Изучение влияния бактериофагов на бактерии с помощью АСМ.// Cборник тезисов «Современные достижения достижения бионаноскопии» Первая Всероссийская Школа-семинар. Москва. - 2007. - С. 29.

57.Ignatov S., Walt D. Bacteria detection – biosensors.// ASI “Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies”. Vichy, France. - 2007. - P. 29-30.

58.Ignatov S., Voloshin A., Ignatyuk T. Bionano – microbiology.// ASI “Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies”. Vichy, France. - 2007. - P.31-32.

59.Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Ganina E. A., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk T.E. Specific AFM visualization of bacteria and bactericidal activity of nano-objects.// IV International conference on “NanoBio and related new and perspective biotechnologies”. Pushchino. - 2007. - P. 193-195.

48

60.Kholodenko V.P., Chugunov V.A., Kobzev E.N., Borzilov A.I., Gerasimov V.N., Biketov S.F., Ignatov S.G., Potapov V.D., Turin E.A., Dyatlov I.A.. Nanotechnologies and problems of biosafety.// IV International conference on “NanoBio and related new and perspective biotechnologies”. Pushchino. - 2007. - P. 199-200.

61.Игнатов С.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. Применение АСМ для специфической визуализации микроорганизмов.// VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Мо-

лекулярная диагностика -2007» - 2007. - Т. 1. - С. 81-82.

62.Ignatov S. G., Voloshin A.G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk T.E.. International expert meeting drug design and development. Мoscow. - 2007. - Р. 14-15.

63.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Дятлов И.А. Электрооптический анализ в микробиологии.// Монография – Оболенск, ГУП МО «Серпуховская типография» - 2007. - С. 1 – 161.

64.Ignatyuk T.E., Ivanova O.E., Efremova T.P., Fedjukina G.N., Voloshin A.G., Akimova L.A., Mochalov V.V., Ignatov S. G. Immobilization of viruses using Langmuir antibody films based on amphiphilic polyelectrolites for Atomic Force microscopy.// In book “Proceedings of the IX Linz Winter workshop 2007”. Austria. - 2008. - Р. 86-90.

65.Дубровин Е.В., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Краевский С.В., Федюкина Г.Н., Яминский И.В.// АСМ-исследование биоспецифичных взаимодействий на поверхностях. «Современные достижения бионаноскопии». Вторая международная конференция. Москва. - 2008. - C. 22.

66.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Специфическая АСМ визуализация бактериальных нанофрагментов.// Международный форум по нанотехнологиям. Сб. тезисов докладов науч- но-технологических секций, т. 2. Москва. - 2008. - С. 150-151.

67.Dubrovin E. V., Voloshin A. G., Kraevsky S. V., Ignatyuk T. E., Abramchuk S. S., Yaminsky I. V. , Ignatov S. G. Atomic Force Microscopy Investigation of Phage Infection of Bacteria.// Langmuir. - 2008. - V. 24. - № 22. - P. 13068– 13074.

68.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Нано в микробиологии: специфическая визуализация бактериальных нанофрагментов и нанотоксичность.// Нанотехнологии в сельском хозяйстве. Доклады Международной научно-практической конференции. Москва. - 2008. - C. 34-36.

69.Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Filippovich S. Yu, Walt R.D. Bacteria detection

– biosensors.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 267-276.

70.Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Virjasov S. N, Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Ganina E.A., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk T.E. Bionano – microbi-

49

ology.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 333-345.

71.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. АСМ анализ взаимодействия фаг-бактерия.// Материалы 1-ой Международной научной школы “Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах”. - 2009. - С. 32

72.Ignatov S.G., Bachurina G.P., Filippovich S.Yu. Evaluation of Antifungal Activity of Multi-functional Bioactive Nano-structured Films for Load-bearing Implants.// European Congress on Advanced Materials and Processes. Glasgow, Scotland. - 2009. - P. 66.

73.Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Филиппович С.Ю., Перовская О.Н. Оценка бактерицидной активности многофункциональных биоктивных наноструктурных покрытий, работающих под нагрузкой.// Тезисы международной конференции «Токсикологические и нормативные аспекты производства и применения наноматериалов в России». Москва. - 2009. - С. 74.

74.Волошин А.Г., Филиппович С.Ю., Бачурина Г.П., Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Спектрометрический анализ летучих компонентов микроорганиз-

мов.// Приклад. биохим. и микробиол. – 2010. - Т. 46. - №3. - С. 331-335.