Радіобіологія фул вершин (передмовалесс, вступлесс етс. едишн)

91

сімейства еволюційно консервативних цистеїнових протеаз. Каспази існують у клітині як неактивні проформи та зимогени, які розщеплюються на активні форми ферментів, активуючи апоптоз. Каспаза становить собою тетрамер, який складається із двох великих (~20 кДa) та двох малих (~10 кДa) субодиниць. Велика та мала субодиниці утворюється в результаті розщеплення прокаспази. Відомо 14 каспаз, які поділяються на ініціатори та ефектори. Ініціатори (каспаза-2, -8, -9,-10 та -11) розщеплюють та активують каспази ефектори (каспаза-3,-6,-7 та -14). Ефектори безпосередньо гідролізують внутрішньоклітинні субстрати, що, у кінцевому випадку, призводить до реорганізації цитоскелету та розпаду клітини на апоптозні тільця.

4. Мітохондріальний шлях. Важливу роль в індукції апоптозу відіграють мітохондрії. Різноманітні індуктори апоптозу прямо чи опосередковано викликають зростання проникності мембран цих органел, що призводить до вивільнення апоптогенних молукел із мітохондрій та загибелі клітини. Крім того, надходження із мітохондрій до цитоплазми активних форм оксигену, нітроген оксиду, рекомбінантних білків Bax та Bak тощо викликають апоптотичну загибель клітин незалежно від активації інших ініціаторних систем клітини, включаючи „рецептори смерті” чи білок p53. Дія цих індукторів апоптозу призводит до різкого зниження величини електрохімічного потенціалу мітохондріальних мембран, яке супроводжується виходом із мітохондрій до цитоплазми важливого компонента дихальної ланки мітохондрій – цитохрома c. Дія білків сімейства Bcl-2 також пов’язана із їх здатністю регулювати вихід до цитоплазми різних проапоптичних медіаторів (впливаючи на існуючі мембранні пори), які локалізовані в мітохондріях (цитохром с, прокаспази-2, -3 та -9).

5. Існують відомості, що апоптоз може також активуватись рецепторонезалежним шляхом при пошкодженні окремих клітинних органел – ендоплазматичного ретикулуму, апарату Гольджі чи лізосом.

Механізм апоптозу властивий не лише клітинам, а також субклітинним та надклітинним структурам. Самоліквідація мітохондрій названа мітоптозом (значну роль в цьому процесі відіграють активні форми оксигену), а органів та тканин –

органоптозом.

РАДІОЧУТЛИВІСТЬ КЛІТИН У РІЗНІ ФАЗИ МІТОТИЧНОГО ЦИКЛУ. Радіочутливість клітин істотно відрізняється у різні фази мітотичного циклу. Поділ клітин – це складний процес, який триває між двома послідовними поділами клітини: від мітозу до мітозу (гр. mitos – нитка). В мітозі виділяють дві фази ( гр. phasis – поява) – інтерфазу і власне мітоз (рис. 3.6).

92

Поділ клітин (мітоз і цитокінез)

M

G2

G0

G1

S

Інтерфаза

Рис. 3.6. Схема клітинного циклу

Інтерфаза (лат. inter – між) – це найдовша фаза клітинного циклу. У цю стадію відбувається ріст клітин, синтез та накопичення нуклеїнових кислот, білка та інших сполук. Інтерфаза поділяється на три стадії. Відразу після закінчення поділу клітин настає перша стадія – пресинтетична, яку позначають символом G1 (G англ. gap – інтервал). За нею настає друга стадія синтезу ДНК і хромосомних білків (S-стадія). Третя стадія – постсинтетична (G2) переходить в профазу, яка є першою стадією власне мітозу (М). Профаза (початок ділення) послідовно переходить в метафазу (розділення хромосом вздовж на дві половинки з невеликим проміжком), анафазу (розходження хромосом до полюсів клітини) і телофазу (формування дочірніх клітин).

Тривалість протікання стадії відносно одна одної відповідає, як правило, наступному ряду: M<G2<S<G1. Найбільш тривалі періоди G1 та S, самий короткий – М. У клітин, які здатні до активного обновлення (епітелій кишковика, кісткового мозку тощо), тривалість циклу складає 10–48 год.

Іонізуюча радіація впливає на всі фази і стадії, але здебільшого найчутливішою є профаза. Використовуючи клітинні популяції, які називають синнхронні, у яких в будь-який момент усі клітини перебувають на однаковій стадії клітинного циклу вдається роздільно оцінити радіочутливість клітин у різних стадіях клітинного цикла за умов їх опромінення (рис. 3.7). Встановлено, що активно проліферуючі клітини найбільш радіочутливі у фазах М та G2 , а найбільш радіостійкі - у фазі S.

Однак, оцінюючи радіочутливість по іншим показникам, наприклад, по показнику затримки поділу клітини, показано, що найбільш радіочутливі у фазі S, а найменш радіочутливі у фазах G2 та G1.

93

Найбільш онкогенна дія іонізуючих випромінювань спостерігається у випадку опромінення клітин, що перебуваютьу фазі G2. У разі дії іонізуючого випромінювання з різними значеннями ЛПЕ характер залежності радіочутливості клітин від фази клітинного цикла має певні відмінності. Для -променів та нейтронів характер залежності радіочутливості клітин від фази клітинного цикла подібні.

У тканинах, які повільно оновлюються, більшість клітин перебувають у стадії G1 і її тривалість може вимірятися роками. У цьому випадку виділяють ще одну стадію – G0 і клітини на цій стадії прийнято вважати спочиваючими. Ці клітини становлять резерв популяції у випадку загибелі частини клітинного пула й становлять основу післярадіаційної репарації тканин.

Багато променевих ушкоджень клітинами переносяться легко, тому що в основному є наслідком пошкодження множинних структур, втрата яких швидко відновлюється. Такі клітинні реакції називають кумулятивним ефектом опромінення.

Виживаність, %

100

50

20

10

5

2

1

0,5

0,2

0 2 4 6 8 10 D, Гр

Рис.3.7. Дозова залежність виживаності синхронізованої популяції клітин китайського хом’ячка, які опромінені у різні фази клітинного цикла:

1 – пізня синтетична; 2 – рання синтетична; 3 – пресинтетична; 4 – мітоз.

Реакції кумулятивного типу з'являються одразу після опромінення й швидко зникають. Найбільш універсальна з них – тимчасова затримка клітинного поділу, названа радіаційним блоком мітозу. Час затримки поділу строго залежить від дози іонізуючого випромінювання й проявляється у всіх клітин незалежно від того виживуть вони в подальшому або загинуть.

Радіаційно-індуковані порушення мітозу можуть бути зворотними та незворотними. При зворотніх порушеннях ділення клітин після

3

певного терміну відновлюється. Затримка поділу клітин залежить від дози опромінення. Для більшості клітин це приблизно 1 год на 1 Гр. У цьому полягає принципова відмінність кумулятивних клітинних ефектів від летальних уражень. Час затримки поділу залежить від стадії циклу, в якій перебувають клітини у момент опромінення. Він найтриваліший тоді, коли впливу іонізуючої радіації зазнають клітини у стані синтезу ДНК або постсинтетичній стадії, а найкоротший – при опроміненні у стадії власне мітозу.

Механізм радіаційної затримки поділу остаточно не з'ясований. Скоріше за все, затримка пов'язана з ушкодженнями внутрішньоклітинних структур відповідальних за регуляцію поділу. Затримка поділу розглядається як захисна функція, її тривалість - міра позбавлення клітин від викликаних випромінюванням ушкоджень. Цю захисну реакцію варто відрізняти від повного пригнічення мітозу, яке настає після впливу великих доз, коли клітина значний час продовжує жити, але незворотньо втрачає здатність до поділу. У результаті часто утворюються патологічні форми гігантських клітин, що містять декілька наборів хромосом внаслідок їх редуплікації в межах однієї й тієї ж клітини (ендомітоз).

КІЛЬКІСНА ОЦІНКА ЗАГИБЕЛІ КЛІТИН. Методи визначення життєздатності клітин за дії іонізуючих випромінювань поділяють на дві групи. До першої групи належать методи в основі яких лежить реєстрація клітин, що вижили по критерію здатності їх до поділу. До другої групи методи, за допомогою яких визначаються морфологічні чи біохімічні характеристики клітин, що можуть свідчити про існування несумісних із життям пошкоджень.

Клоногенна активність клітин. Вона заснована на здатності різних клітин (прокаріот, грибів, рослин, ссавців) утворювати компактні скупчення (клони) на відповідному субстраті. Клоногенні методики (культивування клітин) полягають в наступному: отримання суспензії поодиноких клітин; поміщення точно визначеної кількості клітин в умови in vitro чи in vivo, де відбувається розмноження та утворення колоній; підрахунок кількості колоній. Відношення ефективності клонування у досліді по відношенню ефективності клонування у контролі – це показник, що характеризує кількість клітин, які вижили.

Існує декілька підходів дослідження клоногенної активності:

-колонії у чашках in vitro, при цьому використовується агар для збереження компактності колоній;

-колонії у дифузійних камерах, при цьому клітини у напіврідкому агарі розміщують у дифузійні камери із мембранними фільтрами;

4

- екзоколонії на селезінці чи легенях, що використовується для трансплантації пухлин, які здатні утворювати колонії на інших органах експериментальних тварин після внутрішньовенного введення клітин.

Для кількісної оцінки виживаності клітин після опромінення широковживаним залишається метод, який засновано на властивості клітин утворювати колонії в культурі (клоногенний метод). При використанні цього метода „життєздатними” називають клітини, які зберегли здатність до утворення колоній. Тобто, під терміном „життєздатність” клітин проліферуючих клітин мається на увазі саме збереження їх здатності до размноження. Кількісно виживаність клітин (у відсотках) при заданій дозі опромінення оцінюється як відношення числа колоній, що виросли із опромінених клітин до числа колоній, які виросли в контрольній групі. Отримані за таким методом криві залежності виживаності клітин від дози опромінення подібні для самих різноманітних клітин (від проліферуючих клітин ссавців до одноклітинних організмів, бактерій, вірусів тощо) та для різних видів випромінювань (гамма, рентген тощо) (рис.3.8).

V0

Dq

1008

7

6

5

37 4

3 3

2
1	2

109

8

7

6

5

4

0

1

2

3

4

5

6

Рис. 3.8. Характерні криві виживаності: 1 — бактерії та гаплоїдні дріжджі; 2 — диплоїдні дріжджі та клітини ссавців; 3 — інфузорії та амеби. Стрілками показаний метод визначення D0 та Dq. Вісь абсцис

5

— доза опромінення (умовні одиниці); вісь ординат — виживаність

(%). Масштаб напівлогарифмічний.

ПОНЯТТЯ РАДІОСТІЙКОСТІ АБО РАДІОЧУТЛИВОСТІ.

Радіочутливість (протилежне поняття радіостійкість) – це чутливість біологічних об»єктів до дії іонізуючих випромінювань. Різні види живих організмів суттєво відрізняються по своїй радіочутливості. Існує загальна закономірність: чим складніший організм, тим він більш чутливий до дії радіації. По мірі зростання чутливості до дії іонізуючих випромінювань живі організми можна розмістити у наступним чином: віруси → амеба → черви → кролик → щур → миша → мавпа → собака → людина.

Ступінь радіочутливості варіює і в рамках одного організму: клітини та тканини також відрізняються по радіочуливості.

На клітинному рівні радіочутливість залежить від різних факторів: організації генома, стану системи репарації, вмісту у клітині антиоксидантів, інтенсивності окисно-відновних процесів.

На тканинному рівні виконується правило Бергоньє–Трибондо:

радіочутливість тканини прямо пропорційна проліферативній активності та обернено пропорційна ступеню диференціювання клітин, що її складають. Таким чином, найбільш радіочутливими в організмі будуть тканини, що інтенсивно діляться, швидко ростуть та малоспеціалізовані, наприклад, кровотворні клітини кісткового мозку, епітелій тонкої кишки та шкіри. Найменш радіочутливі – спеціалізовані тканини, які слабо оновлюються, наприклад, м»язова, кісткова. Однак, тканини, які резистентні до безпосереднього впливу іонізуючих випромінювань, можуть бути чутливі стосовно віддалених наслідків.

На рівні органів радіочутливість залежить від не тільки від радіочутливості тканин, із яких вони складаються, але і від їх функцій. Більшість тканин дорослої людини відносно мало чутливі дії радіації. Нирки витримують сумарну дозу близько 23 Гр за місяць, без особливої шкоди, печінка – близько 40 Гр за месяц, сечовий міхур

– 55 Гр за за місяць, а зріла хрящева тканини – до 70 Гр.

На популяційному рівні радіочутливість залежить від наступних факторів:

-особливостуй генотипа (у людській популяції 10–12% людей відрізняються підвищеною радіочутливістю);

-фізіологічного (наприклад, сон, бадьорість, вагітність) чи патофізіологічного стану організма (наприклад, хронічні захворювання, опіки, механічні травми);

6

-статі (чоловіки більш радіочутливі);

-вік (наименш чутливі люди пожилого віку).

В якості критерія радіочутливості в радіобіології прийнято значення мінімальної дози, при котрій половина опроміненних об`єктів (для багатоклітинних організмів) виживуть після ураження - ЛД50. У якості критерія радіостікості (радіорезистентності) використовують також показник До (для клітин), що на експоненційних частинах дозових залежностей дорівнює Д37, тобто рівні виживаності у 37% від контролю, виживаність якого приймається за -1 або за 100 % (див. рис.3.10 ).

Таким чином, ми підійшли до кількісної оцінки радіочутливості біологічних об”єктів, у тому числі клітинної радіочутливості.

Крива доза-ефект. Результати експериментів стосовно дозової залежності виживаності від дози опромінення досліджуваних об`ектів представляють у лінійному чи напівлогрифмічному масштабі (рис.3.9). На осі ординат відкладено відносний показник радіаційного ефекту N/No , де N – число об`єктів, що не були уражені дією радіації, No- число опромінених об`єктів. На осі абсцис – відкладають різні дози опромінення у лінійному масштабі. Зрозуміло, що при використанні таких координат, виживаність може мінятися від 1 до 0.

N/N0	A			N/N0	Б
1,0				1
				0,8
0,8				0,6
				0,4
0,6				0,2
0,4				0,1
				0,08
0,2				0,06
0,1				0,04
0	1	2	3	0	1	2	3
	Поглинута доза, Гр				Поглинута доза, Гр

Рис.3.9. Криві виживаності клітин (N/No) (криві доза-ефект) при дії щільноіонізуючого випромінення. А-лінійні координати. Б-напів- логарифмічні координати.

Криві залежності виживаності від дози опромінення зручно представляти у системі напівлогарифмічних координат (дозу

7

випромінювання відкладають на шкалі абсцис у лінійному масштабі, а виживаності на ординат у логарифмічному) (рис. 3.10). Крива, що представлена на рис 3.9, Б відповідає самій простій експоненціальній залежності, яка у напівлогарифмічному масштабі перетворюється на пряму лінію. Експоненціальний хід кривої виживаності означає, що коли при дозі Д1 - виживаність складає а1, то при збільшенні дози опромінення до 2 Д1 – виживаність такого об`екту буде у двічі меньша - а1 / 2 . Тобто подвоєння дози опромінення, означає зменшення виживаності удвічі.

Крива на рис 3.10 – це крива, яку ще назвають дозовою кривою з «плечем». На таких кривих спостерігається початкова частина в області малих доз опромінення, коли виживаність практично не відрізняється від -1. Але при дальшому збільшенні доз опромінення формується типова експоненційна частина, яка у напівлогарифмічному масштабі перетворюється на пряму лінію. Доза

при якій	починається цей експоненційна частка, нзвають дозою Dq
- дозою плеча. Інший тип кривих виживаності характерний						для
кривих	виживаності	складних	багатоклітинних		організмів,	має
відверто	пороговий	характер.	До	значення	порогової	дози
виживаність такого		досліджуваного		об`єкту	практично	мало

відрізнється від -1, а за порогом виживаність різко спадає практично до - 0.

Якщо при опроміненні іонізуючими частинками криві виживаності мають експоненційний вигляд - не мають плеча, то така залежність описується рівнянням :

N	e	D D
		o
N o

де N- кількість клітин, що вижили, N0- загальна кількість клітин, D - доза випромінювання, D0 – доза, достатня щоб усі клітин отримали по одному попаданню.

При D =D0 частина клітин, що вижили дорівнює:

N/N0 = e-1=0,367

Таким чином, при дозі опромінення яка дорівнює D0 виживає 36,7% і гине 63,3% клітин популяції. Це пов'язане з тим, що в дійсності при опроміненні частина дози витрачається на вже ушкоджені клітини, яких по розподілу Пуассона буде 36,7%. Величина D0 служить показником радіочутливості клітин і визначається по кривій виживаності як доза, за якої виживає 37%

8

клітин з вихідної кількості. Тому ще її називають D37, що у випадку експоненційної дозової залежності одне й теж.

Для кривих, що мають плече, D0 й D37 відрізняються. Частіше за все це відбувається за дії рідкоіонізуючих випромінювань. Криві, що

мають плече, часто описують рівнянням:
N/N0 = 1- (1- e-D/D0)n
n- екстраполяційне число, яке визначається	як значення

ординати в місці її перетинання із продовженням експоненційного відрізка кривої виживаності.

N/N0

10

5

2

1,0

0,5

0,37

0,2

0,1

0,05

0,037

0,02

0,01

0,005

0,0037

0,002

0,001

n=6

Dq = 2,2 Гр D0 = 1,15 Гр Dq D37= 2,8 Гр

D37

1 е

		1
			е
			D0
2	4	6	8

Доза опромінення, Гр

Рис. 3.10. Характерні криві виживаності клітин при дії рідкоіонізуючого випромінювання.

Тут величина D0 (середньолетальна клітинна доза) визначається як доза, що знижує виживаність в е разів на прямолінійній ділянці кривої доза-ефект, як правило, для клітин ссавців вона складає 1-2 Гр. Плече на кривій виживаності визначає здатність клітин відновлювати життєздатність шляхом репарації. Репараційні здатності клітин вичерпуються після доз 300-500 сГр. Мірою здатності клітин до

9

репарації є величина плеча Dq. Вона визначається як доза випромінювання, що відповідає точці перетинання екстрапольованої ділянки експоненційної частини кривої виживання з віссю абсцис, проведеної на рівні 100% виживання (рис. 3.10). D0 на кривих, які мають плече, визначаються на експоненційній ділянці. D0, Dq та n – основні параметри, що характеризують радіочутливість клітин. Чим вони вищі, тим менш радіочутливі клітинні популяції. Ці параметри пов’язані між собою співвідношенням:

	Dq
Dq = D0 ln n	D0 = ——
	ln n

Таким чином, специфічною особливістю летальних реакцій клітин є те, що зі збільшенням дози збільшується не стільки ступінь ураження всіх опромінених клітин, скільки відсоток уражених. Інакше кажучи, навіть при найменших дозах може бути зареєстрована загибель клітин, з іншого боку, при дуже великих дозах можуть зберігатись окремі життєздатні клітини.

ПІСЛЯРАДІАЦІЙНЕ ВІДНОВЛЕННЯ КЛІТИН. При опроміненні в клітинах можуть виникати пошкодження, які зумовлюють їх загибель. Вони характеризуються, як:

-сублетальні, що самі по собі не призводять до загибелі клітини, але знижують її стійкість до подальших опромінень;

-потенційно летальні, які призводять до загибелі кітини, якщо вони не будуть усунуті, тобто репаровані;

-летальні, які не піддаються репарації та неминуче призводять до загибелі клітини.

Післярадіаційне відновлення клітин – це процес ліквідації явних чи

(та) прихованих пошкоджень. За умов явних пошкоджень, відновлення полягає в поверненні властивостей об’єкта після періода змін його властивостей внаслідок опромінення. За умов прихованого пошкодження (потенційно летального) відновлення полягає у втраті властивості до реалізації пошкодження.

Розрізняють декілька видів репарації. Дореплікативна репарація (до етапу подвоєння ДНК) може відбуватися внаслідок з’єднання розривів ДНК або видалення пошкоджених основ. За післяреплікативної репарації клітина зберігає життєдіяльність незважаючи на наявність певних дефектів ДНК. Реплікативна репарація пов’язана з відновленням ДНК в процесі її репарації шляхом усунення пошкоджень.

Згідно концепції „потенційних пошкоджень” в результаті поглинання енергії іонізуючих випромінювань, окремі потрапляння