17.Методы анализа днк. Днк-диагностика наследственных заболеваний.

ПЦР – полимеразная цепная реакция.

Разработчик Кэрри Муллис. Позволяет накопить необходимое количество изучаемого участка ДНК. Таким образом резко повышается чувствительность диагностических методологий.

Компоненты ПЦР:

1)Образец изучаемой ДНК

2)Термофильная ДНК-полимераза. Активность этого фермента регулируется температурой среды.

3)Праймеры – короткие искусственно синтезируемые участки ДНК. Их создают таким образом,чтобы праймеры прикреплялись к ДНК на концах изучаемого участка. Таким образом, праймеры ограничивают, фланкируют изучаемый фрагмент ДНК.

4)Нуклеотиды.

5) Соли Mg(необходимы для активации фермента)

Этапы ПЦР:

1)Выделение ДНК из исследуемого материала. В настоящее время её выделяют специальными приборами. Это повышает эффективность ДНК.

2)Сборка реакционной смеси. В специальные пробирки в определенном соотношении вносят компоненты реакций. Необходимо тщательно избегать загрязнения материала посторонними образцами ДНК

3)Собственно ПЦР. Для её проведения используют термоцитлеры. Термоцитлер изменяет температуру реакционной смеси согласно заложенной программе.

А)Денатурация ДНК(92-95⁰С, 10 секунд). За счет высокой температуры происходит разрушение водородных связей между цепями ДНК.

Б)Отжиг праймеров(30-50 градусов, 20-30 секунд). Праймеры по принципу комплементарности присоединяются в области концов изучаемого фрагмента ДНК.

Праймер присоединяется ближе к 3' – концу матричной цепи ДНК, так как синтез дочерней цепи идет в направлении 5' -------3'

В) Синтез ДНК(65-70 градусов, 30-40 секунд)

Размеры синтезированного участка ДНК зависят от времени, отведенного на этот этап. Поэтому режим этого этапа подбирается для каждой реакции. В результате указанных этапов нужным нам фрагмент ДНК имеется в двух копиях. Вся остальная ДНК имеется в одном экземпляре.

Процесс – циклический, многократно повторяющийся.

1¹Иногда удвоение ДНК обозначают термином репликация, оставляя термин редупликация для обозначения удвоения хромосом.

1¹Ряд авторов включают в митотический аппарат также хромосомы.