2.3.3 Зимография с козеином

Характеризацию пула кальпаинов проводили также методом зимографии с казеином согласно методу (Arthur, Mykles, 2000). Общую фракцию цитоплазматических и мембраносвязанных белков получали центрифугированием тканевых гомогенатов (105000 g, 30 мин) в 50 мМ HEPES-NaOH-буфере (рН 7.6), содержащем 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 0.1% тритон Х-100, 5 мМ EDTA, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и ингибиторы протеиназ (0.1 мМ PMSF, 10 мкг/мл лейпептин) (соотношение 1:10, вес/объем). Разделяли белки (30 мкг на дорожку) в 12% ПААГ, сополимеризованном с казеином («Bio-Rad», США) в концентрации 0.2%. Этап нативного электрофореза сопровождался инкубацией геля в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.2), содержащем 10 мМ меркаптоэтанола и 5.0 мМ СаCl₂, и его стандартной окраской Coomassie brilliant blue R-250.

Реактивы для зимографии:

1. Раствор казеина:

10 мг/мл казеина в 0,75 М Трис-HCl-буфере, рН=8,8 (50%-ный буфер А).

2. Буфер для инкубации с кальцием (объем 1 л):

• 50 мМ Трис-HCl-буфер, навеска 6,057 г, рН = 7-7,2 при комнатной температуре

• 5 мМ хлорид кальция, навеска 0,735 г

• 10 мМ ДТТ, навеска 1,54 г

• Довести объем в колбе до 1 л б/д водой

2.3.4 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Электрофорез белков в полиакриламидном геле – метод разделения смесей белковв полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью, детерминированной длиной полипептидной цепочки, молекулярной массой, укладкой белковой молекулы, посттрансляционными модификациями и другими факторами. Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофорезабелков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия(SDS) по Лэммли (Laemmli, 1970).

1. 30 % раствор акриламида (акриламид : бис- акриламид =74,1 : 1) (объем 100 мл)

• 29,6 г акриламида;

• 0,4 г бис-акриламида;

• растворить в 100 мл б/д воды;

• профильтровать; хранить в тёмном месте.

2. Буфер А: 1,5 М трис-HCl-буфер, рH =8,8 (объем 200 мл)

• 36,312 г трис на 200 мл б/д воды

3. Буфер В: 0,5 М Трис-НCl-буфер, pH= 6,8 (объем 200 мл)

• 12,114 г трис на 200 мл б/д воды

• рН довести концентрированной HCl до нужного рН

4. 50% SLB-буфер:

• 20% глицерин, берём для приготовления 25 мл глицерина

• 25 мл 0,1 М Трис-HCl, рН=6,8

• 10 мМ ЭДТА, навеска 0,47 г

• 10 мМ 2-меркаптоэтанола, берём для приготовления 100 мкл

• 0,02 % бромфенолового синего, навеска 0,03 г

5. Буфер для электрофореза (5-кратный), рН = 8. Не требует подведения рН (объем 1 л):

• 125 мМ Трис, навеска 15,14 г

• 626 мМ глицерина, навеска 46,92 г

• 5 мМ ЭДТА, навеска 1,86 г.

• Непосредственно перед использованием разбавить до однократного, добавить 10 мМ 2-МЭ (или 1 мМ ДТТ), для этого к 200 мл 5х-буфера прилить 800 мл б/д воды и добавить 0,8 мл 2-МЭ

6. Фиксаж:

• 45% этанол

• 45% вода

• 10% уксусная кислота

7. Окраска:

• 0,5% кумасси

• 10% уксусная кислота

• 40% этанол

• 50% вода

8. Отмывка:

• 10% уксусная кислота

9. Лизирующий буфер (для гомогенизации) (объём 200 мл)

• 50 мМ HEPES, навеска 2,384 г, pH 7,6 (довести конц. щёлочью)

• 150 мМ хлорид натрия, навеска 1,77 г

• 10% глицерин, объём 20 мл

• 0,1% Тритон Х-100, объём 0,2 мл

• 5 мМ ЭДТА, навеска 0,3724 г.

• 10 мМ ДТТ, навеска 0,308 г.